Документ 994_a14, текущая редакция — Принятие от 30.05.2008

                  Регламент Ради (ЄС) N 440/2008 
"Що встановлює методи тестування
відповідно до Регламенту Європейського Парламенту
та Ради (ЄС) N 1907/2006 про реєстрацію, оцінку,
авторизацію і обмеження хімічних речовин
та препаратів (REACH)"
від 30 травня 2008 року
(Текст має значення для ЄЕП)

КОМІСІЯ ЄВРОПЕЙСЬКИХ СПІВТОВАРИСТВ,
Беручи до уваги Договір про заснування Європейського
Співтовариства ( 994_017 ),
Беручи до уваги Регламент Європейського Парламенту та Ради
(ЄС) N 1907/2006 від 18 грудня 2006 року про реєстрацію, оцінку,
авторизацію і обмеження хімічних речовин та препаратів (REACH),
яким засновується Європейське Агентство хімічних речовин і
препаратів, вносяться зміни до Директиви 1999/45/ЄС і скасовуються
Регламент Ради (ЄЕС) N 793/93 і Регламент Комісії (ЄС) N 1488/94,
а також Директива Ради 76/769/ЄЕС і Директиви Комісії 91/155/ЄЕС,
93/67/ЄЕС, 93/105/ЄС і 2000/21/ЄС(1), та зокрема, частину 3 його
статті 13,
---------------- (1) OB L 396, 30.12.2006, C. 1, з виправленнями, внесеними
OB L 136, 29.5.2007, C. 3.
Оскільки:
(1) Відповідно до Регламенту (ЄС) N 1907/2006 методи
тестування мають бути ухвалені на рівні Співтовариства для цілей
тестування речовин у випадку, якщо необхідно отримати інформацію
про основні властивості таких речовин.
(2) Директивою Ради 67/548/ЄЕС від 27 червня 1967 року щодо
наближення законів, підзаконних актів та адміністративних положень
про класифікацію, упакування та маркування небезпечних речовин(2)
встановлено, в Додатку V, методи для визначення фізико-хімічних
властивостей, токсичності та екотоксичності речовин і препаратів.
Додаток V до Директиви 67/548/ЄЕС видалений Директивою
Європейського Парламенту та Ради 2006/121/ЄС, що набирає чинності
з 1 червня 2008 року.
---------------- (2) OB L 196, 16.8.1967, C. 1. Директива з останніми змінами,
внесеними Директивою Європейського Парламенту та Ради 2006/121/ЄС
(OB L 396, 30.12.2006, C. 850, з виправленнями, внесеними
OB L 136, 29.5.2007, C. 281).
(3) Методи тестування, передбачені Додатком V до Директиви
67/548/ЄЕС, мають бути включені до цього Регламенту.
(4) Цим Регламентом не виключається використання інших
методів тестування, за умови, що їх використання відповідає
частині 3 статті 13 Регламенту 1907/2006.
(5) Принципи заміни, скорочення та удосконалення процедури
використання тварин під час досліджень мають бути повністю
враховані при розробці методів тестування, зокрема у випадку, коли
відповідні затверджені методи стають доступними для заміни,
скорочення або вдосконалення процедури тестування на тваринах.
(6) Положення цього Регламенту відповідають висновку
Комітету, заснованому відповідно до статті 133 Регламенту (ЄС)
N 1907/2006.
УХВАЛИЛА ЦЕЙ РЕГЛАМЕНТ:
Стаття 1
Методи тестування, що мають застосовуватися для цілей
Регламенту 1907/2006/ЄС, передбачені в Додатку до цього
Регламенту.
Стаття 2
Комісія переглядає, за необхідності, методи тестування,
передбачені цим Регламентом, з метою заміни, скорочення або
вдосконалення тестування на хребетних тваринах.
Стаття 3
Всі посилання на Додаток V до Директиви 67/548/ЄЕС мають
розглядатися як посилання на цей Регламент.
Стаття 4
Цей Регламент набуває чинності на наступний день після його
публікації в Офіційному віснику Європейського Союзу.
Цей Регламент застосовується з 1 червня 2008 року.
Вчинено в Брюсселі 30 травня 2008 року.
За Комісію Stavros DIMAS
Член Комісії

Додаток

ЧАСТИНА А: МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ
ВЛАСТИВОСТЕЙ

ЗМІСТ
А.1. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕННЯ/ЗАТВЕРДІННЯ
А.2. ТЕМПЕРАТУРА КИПІННЯ
А.3. ВІДНОСНА ГУСТИНА
А.4. ПРУЖНІСТЬ ПАРИ
А.5. ПОВЕРХНЕВЕ НАТЯГНЕННЯ
А.6. РОЗЧИННІСТЬ У ВОДІ
А.8. КОЕФІЦІЄНТ РОЗПОДІЛУ
А.9. ВИЗНАЧЕННЯ ТЕМПЕРАТУРИ СПАЛАХУ
А.10. ЗАЙМИСТІСТЬ (ТВЕРДІ РЕЧОВИНИ)
А.11. ЗАЙМИСТІСТЬ (ГАЗИ)
А.12. ЗАЙМИСТІСТЬ (КОНТАКТ З ВОДОЮ)
А.13. ВЛАСТИВІСТЬ САМОЗАПАЛЕННЯ ТВЕРДИХ ТІЛ ТА РІДИН
А.14. ВИБУХОНЕБЕЗПЕЧНІСТЬ
А.15. ТЕМПЕРАТУРА САМОЗАПАЛЕННЯ (РІДИНИ ТА ГАЗИ)
А.16. ВІДНОСНА ТЕМПЕРАТУРА САМОЗАПАЛЕННЯ ДЛЯ ТВЕРДИХ ТІЛ
А.17. ВЛАСТИВОСТІ ОКИСЛЕННЯ (ТВЕРДІ ТІЛА)
А.18. СЕРЕДНЯ МОЛЕКУЛЯРНА МАСА ТА
МОЛЕКУЛЯРНО-МАСОВИЙ РОЗПОДІЛ ПОЛІМЕРІВ
А.19. СКЛАД НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНИХ ПОЛІМЕРІВ
А.20. ОСОБЛИВОСТІ ПОВЕДІНКИ ПОЛІМЕРУ В ВОДІ ПРИ
РОЗЧИНЕННІ/ВИОКРЕМЛЕННІ
А.21. ОКИСЛЮВАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ РІДИН

А.1. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕННЯ/ЗАТВЕРДІННЯ
1. МЕТОДИКА
Більшість описаних методів ґрунтуються на Рекомендаціях ОЕСР
з тестування (1). Основні принципи наведені в посиланнях (2) та
(3).
1.1. ВСТУП
Описані методи та засоби мають застосовуватися для визначення
температури плавлення речовин, без будь-яких обмежень стосовно
ступеня їх чистоти.
Вибір методу залежить від природи речовини, що має
тестуватися. Для результату обмежуючим фактором є те, чи може
рідина бути розпиленою з легкістю, важко або взагалі не може бути
розпилена.
Для деяких речовин визначення температура загусання або
затвердіння є більш доцільною, при цьому стандарти для такого
визначення були також включені до цього методу.
Якщо внаслідок особливих властивостей речовини жоден з
вищеназваних параметрів не може бути виміряний належним чином,
може бути доцільним визначення точки втрати текучості.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
Температура плавлення визначається як температура, при якій
фазовий перехід з твердого до рідкого стану відбувається при
атмосферному тиску і така температура ідеально відповідає
температурі затвердіння.
Оскільки фазовий перехід багатьох речовин відбувається в
межах певного температурного діапазону, він часто описується як
діапазон плавлення.
Перетворення одиниць (з К у град.С)
t = T - 273,15
t: температура за Цельсієм, градусів Цельсія (град.С)
T: абсолютна температура, Кельвіни (К)
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
При дослідженні будь-якої нової речовини немає потреби
застосовувати еталонні речовини. Головним чином, вони мають
слугувати для періодичної перевірки застосування методу, а також
порівняння з результатами, отриманими за допомогою інших методів.
Деякі калібрувальні речовини перераховані в посиланнях (4).
1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Визначається температура (температурний діапазон) фазового
переходу з твердого стану у рідкий або з рідкого стану у твердий.
На практиці під час нагрівання/охолодження зразка тестової
речовини при атмосферному тиску визначаються температури
первинного плавлення/затвердіння та кінцева стадія
плавлення/затвердіння. Описано п'ять типів методів, а саме:
капілярний метод, методи високих температур, визначення
температури затвердіння, методи термічного аналізу, а також
визначення точки втрати текучості (згідно розробок для нафтових
масел).
У деяких випадках може бути доцільним замість температури
плавлення вимірювати температуру затвердіння.
1.4.1. Капілярний метод
1.4.1.1. Прилади з рідинною ванною для визначення температури
плавлення
Невелика кількість дрібно розмеленої речовини поміщається в
капілярну трубку та щільно закривається. Трубка нагрівається разом
з термометром, при цьому зростання температури налаштовується на
менш, ніж 1 К/хв. протягом всього плавлення. Визначаються
початкова та кінцева температури плавлення.
1.4.1.2. Прилади з металевим блоком для визначення
температури плавлення
Згідно підпункту 1.4.1.1., за виключенням того, що капілярна
трубка та термометр розміщуються у нагрітому металевому блоці, при
цьому через отвори в блоці за ними може проводитись спостереження.
1.4.1.3. Виявлення з допомогою фотоелементів
Зразок у капілярній трубці автоматично нагрівається в
металевому циліндрі. Пучок променів світла направляється через
речовину за допомогою отвору в циліндрі на точно калібрований
фотоелемент. Під час плавлення оптичні властивості більшості
речовин змінюються від непрозорих до прозорих. Інтенсивність
світла, що досягає фотоелемента, зростає і ним надсилається сигнал
про зупинку до цифрового індикатора, що зчитує температуру з
платинового термометра опору, розташованого в камері нагріву. Цей
метод не підходить для деяких інтенсивно забарвлених речовин.
1.4.2. Високотемпературні дослідження
1.4.2.1. Стержень розжарення Кофлера
Стержень розжарення Кофлера складається з двох частин металу
різної теплопровідності, що нагріваються електричним шляхом, зі
стержнем, сконструйованим таким чином, щоб температурний градієнт
був майже лінійним по всій його довжині. Температура стержня
розжарення може варіюватися від 283 до 573 К, що визначається
спеціальним приладом для зчитування температурних показників,
включаючи бігунок з покажчиком та перемикачем, розробленими
спеціально для стержня. Для визначення температури плавлення
речовина поміщається тонким шаром безпосередньо на поверхню
стержня розжарювання. Через кілька секунд з'являється чітка лінія
розподілу між рідкою та твердою фазами. Температура на лінії
розподілу зчитується шляхом прилаштування покажчика до стержня на
цій лінії.
1.4.2.2. Мікроскоп для визначення температури плавлення
Деякі мікроскопи для високотемпературних досліджень
використовуються для визначення температур плавлення при дуже
малих кількостях матеріалу. В більшості нагрівальних приладів
температура вимірюється чутливим термоелементом, але іноді
застосовуються ртутні термометри. Типовий прилад для визначення
температури плавлення складається з камери нагрівання, що містить
металеву пластину, на яку тонким шаром поміщається зразок. В
центрі металевої пластини міститься отвір, що дозволяє проходити
пучкам світла з освітлювального дзеркала мікроскопа. При
використані камера закривається скляною пластинкою для виключення
виходу повітря з зони зразка.
Нагрівання зразка регулюється реостатом. Для надточних
вимірювань на оптично анізотропних речовинах може застосовуватися
поляризоване світло.
1.4.2.3. Менісковий метод
Цей метод застосовується спеціально для поліамідів.
Температура, за якої зміщується меніск силіконового масла,
розташованого між стержнем розжарювання та покривним склом,
підтримуваним дослідним зразком поліаміду, визначається візуально.
1.4.3. Метод визначення температури затвердіння
Зразок вводиться в спеціальну пробірку та поміщається в
прилад для визначення температури затвердіння. Зразок постійно
обережно перемішується протягом охолодження, а температура
вимірюється через відповідні проміжки часу. Коли температура
матиме однакові значення протягом кількох послідовних вимірювань,
така температура (скоригована з урахуванням похибки, передбаченої
для термометра) фіксується в якості температури затвердіння.
Слід уникати надмірного охолодження шляхом підтримання
рівноваги між твердою та рідкою фазами.
1.4.4. Термічний аналіз
1.4.4.1. Диференціальний термічний аналіз (ДТА)
Цим методом фіксується різниця температур між речовиною та
еталонним матеріалом як функція температури під час того, як
речовина та еталонний матеріал піддаються однаковій
терморегулюючій програмі. Коли в зразку відбувається перехід, що
спричиняє зміну тепловмісту, ця зміна вказується ендотермічним
(плавлення) або екзотермічним (затвердіння) відхиленням від
базової лінії температурних показників.
1.4.4.2. Диференціальна скануюча калориметрія (ДСК)
Цим методом фіксується різниця споживаної енергії речовини та
еталонного матеріалу як функція температури під час того, як
речовина та еталонний матеріал піддаються однаковій
терморегулюючій програмі. Ця енергія є енергією, необхідною для
встановлення нульової температурної різниці між речовиною та
еталонним матеріалом. Коли в зразку відбувається перехід, що
спричиняє зміну тепловмісту, ця зміна вказується ендотермічним
(плавлення) або екзотермічним (затвердіння) відхиленням від
базової лінії показників теплового потоку.
1.4.5. Точка втрати текучості
Цей метод розроблено для використання в роботі з мінеральними
маслами, при цьому він підходить для використання з маслянистими
речовинами за низьких температур плавлення.
Після попереднього нагрівання зразок охолоджується зі
встановленою швидкістю, при цьому з інтервалом у 3 К перевіряються
характеристики потоку. Найнижча температура, при якій
спостерігається рух речовини, фіксується як точка втрати
текучості.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Застосовність та точність різних методів, що використовуються
для визначення температури плавлення/температурного діапазону
плавлення, вказуються в наступній таблиці:
ТАБЛИЦЯ: МОЖЛИВІСТЬ ЗАСТОСОВУВАННЯ МЕТОДУ
А. Капілярний метод
-------------------------------------------------------------------------------- | Метод | Речовини, | Речовини, |Температурний| Точність | Існуючі | | вимірювання | які можуть | що не можуть | діапазон |розрахунку|стандарти| | |подрібнюватись| легко | | (1) | | | | |подрібнюватися| | | | |-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------| |Прилади з | так | лише деякі | 273-573 К | +- 0,3 К | JIS К | |рідинною | | | | | 0064 | |ванною для | | | | | | |визначення | | | | | | |температури | | | | | | |плавлення | | | | | | |-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------| |Прилади з | так | лише деякі | від 293 | +- 0,5 К |ISO 1218 | |металевим | | | до > 573 К | | (Е) | |блоком для | | | | | | |визначення | | | | | | |температури | | | | | | |плавлення | | | | | | |-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------| |Виявлення з | так | декілька з | 253-573 К | +- 0,5 К | | |допомогою | |застосуванням | | | | |фотоелементів| | приладів | | | | --------------------------------------------------------------------------------
---------------- (1) Залежно від типу інструменту та ступеня чистоти речовини.
В. Високотемпературні дослідження
та методи визначення температури затвердіння
-------------------------------------------------------------------------------- | Метод | Речовини, | Речовини, |Температурний| Точність | Існуючі | | вимірювання | які можуть | що не можуть | діапазон |розрахунку|стандарти| | |подрібнюватись| легко | | (1) | | | | |подрібнюватися| | | | |-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------| |Стержень | так | ні | від 283 | +- 1 К |ANSI/ASTM| |розжарення | | | до > 573 К | |D 3451-76| |Кофлера | | | | | | |-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------| |Мікроскоп | так | лише деякі | від 273 | +- 0,5 К |DIN 53736| |для | | | до > 573 К | | | |визначення | | | | | | |температури | | | | | | |плавлення | | | | | | |-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------| |Менісковий | ні |спеціально для| від 293 | +- 0,5 К |ISO 1218 | |метод | | поліамідів | до > 573 К | | (Е) | |-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------| |Температура | так | так | 223-573 К | +- 0,5 К |напр. BS | |затвердіння | | | | | 4695 | --------------------------------------------------------------------------------
---------------- (1) Залежно від типу інструменту та ступеня чистоти речовини.
С. Термічний аналіз
-------------------------------------------------------------------------------- | Метод | Речовини, | Речовини, |Температурний| Точність | Існуючі | | вимірювання | які можуть | що не можуть | діапазон |розрахунку|стандарти| | |подрібнюватись| легко | | (1) | | | | |подрібнюватися| | | | |-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------| |Диференціаль-| так | так | 173-1273 К | до 600 К | ASTM Е | |ний | | | |+- 0,5 К, | 537-76 | |термічний | | | |до 1273 К | | |аналіз (ДТА) | | | |+- 2,0 К | | |-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------| |Диференціаль-| так | так | 173-1273 К | до 600 К | ASTM Е | |на скануюча | | | |+- 0,5 К, | 537-76 | |калориметрія | | | |до 1273 К | | |(ДСК) | | | | +- 2,0 К | | --------------------------------------------------------------------------------
---------------- (1) Залежно від типу інструменту та ступеня чистоти речовини.
D. Точка втрати текучості
-------------------------------------------------------------------------------- | Метод | Речовини, | Речовини, |Температурний| Точність | Існуючі | | вимірювання | які можуть | що не можуть | діапазон |розрахунку|стандарти| | |подрібнюватись| легко | | (1) | | | | |подрібнюватися| | | | |-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------| |Точка | для | для | 223-323 К | +- 0,3 К | ASTM D | |втрати | мінеральних | мінеральних | | | 97-66 | |текучості | масел та | масел та | | | | | | маслянистих | маслянистих | | | | | | речовин | речовин | | | | --------------------------------------------------------------------------------
---------------- (1) Залежно від типу інструменту та ступеня чистоти речовини.
1.6. ОПИС МЕТОДІВ
Порядок проведення практично всіх методів тестування був
описаний у міжнародних та національних стандартах (див.
Додаток 1).
1.6.1. Методи з застосуванням капілярної трубки
Піддаючись повільному зростанню температури, подрібнені
речовини зазвичай проходять етапи плавлення, наведені на
малюнку 1.

Малюнок 1
( 994_b14 )

Протягом визначення температури плавлення температурні
показники фіксуються на початковому та кінцевому етапі плавлення.
1.6.1.1. Прилади з рідинною ванною для вимірювання
температури плавлення
На малюнку 2 показано тип стандартизованого приладу для
вимірювання температури плавлення, виготовленого зі скла
(JIS K 0064); всі специфікації вказані в міліметрах.

Малюнок 2
( 994_b14 )

Рідина в ванні:
Має бути обрана відповідна рідина. Вибір рідини залежить від
температури плавлення, що має бути визначена, наприклад,
вазелінове масло - для температур плавлення не більше 473 К,
силіконове масло - для температур плавлення не більше 573 К.
Для температур плавлення вище 523 К може використовуватися
суміш, що складається з трьох частин сірчаної кислоти та двох
частин сульфату калію (у масових пропорціях). У випадку
використання подібних сумішей має бути вжито відповідних заходів
безпеки.
Термометр:
Слід користуватися лише такими термометрами, які відповідають
вимогам наступних стандартів або їх еквівалентів:
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
Порядок визначення:
Суха речовина мілко подрібнюється в ступці та висипається в
капілярну трубку, запаяну з одного боку, таким чином, щоб рівень
наповнення складав близько 3 мм після його ущільнення. Для
отримання зразка з однорідним ущільненням капілярна трубка має
бути опущена з висоти близько 700 мм через скляну трубку
вертикально на скло спостереження.
Наповнена капілярна трубка розміщується в ванні таким чином,
щоб середня частина голівки ртутного стовпчика термометра
торкалася капілярної трубки у частині, де розміщено зразок.
Зазвичай капілярна трубка встановлюється в приладі за температури,
що приблизно на 10 К нижча температури плавлення.
Рідина в ванні нагрівається таким чином, щоб підвищення
температури відбувалося зі швидкістю близько 3 К/хв. Рідину слід
помішувати. За температури близько 10 К нижче очікуваної
температури плавлення швидкість підвищення температури
встановлюється на максимальному рівні 1 К/хв.
Розрахунок:
Розрахунок температури плавлення відбувається наступним
чином:
Т = Т + 0,00016 (T - T ) n
D D E
де:
Т = скоригована температура плавлення в К
T = температурний показник термометра D в К D
T = температурний показник термометра Е в К E
n = кількість поділок на виступаючому стовпчику ртуті у
термометрі D.
1.6.1.2. Прилади з металевим блоком для вимірювання
температури плавлення
Прилад
Складається з наступних деталей:
- циліндричний металевий блок, верхня частина якого відкрита
і має вигляд камери (див. мал. 3),
- металева пробка з одним чи двома отворами, через які в
металевий блок вводяться трубки,
- система нагрівання для металевого блоку, забезпечена,
наприклад, електричним опором, вбудованим у металевий блок,
- реостат для регулювання вхідної потужності, якщо
використовується електричне нагрівання,
- чотири отвори з жаростійкого скла на бокових стінках
камери, діаметрально розташовані під прямими кутами одне до
одного. Навпроти одного з цих отворів вбудовано окуляр для
спостереження за капілярною трубкою. Інші три отвори
використовуються для освітлення внутрішньої частини камери
лампами,
- капілярна трубка з жаростійкого скла, закрита з одного
кінця (див. 1.6.1.1).
Термометр:
Див. стандарти, вказані в підпункті 1.6.1.1. Можуть також
застосовуватися прилади для термоелектричного вимірювання з
аналогічним рівнем точності.

Малюнок 3
( 994_b14 )

1.6.1.3. Виявлення з допомогою фотоелементів
Прилад та порядок вимірювання:
Прилад складається з металевої камери з автоматизованою
системою нагрівання. Три капілярні трубки наповнюються відповідно
до підпункту 1.6.1.1. та поміщаються в термокамеру.
Для калібрування приладу можливі кілька лінійних підвищень
температури, при цьому відповідне підвищення температури
встановлюється електричними засобами на рівні, що знаходиться
перед обраним постійним та лінійним показником. Самописці вказують
фактичну температуру термокамери та температуру речовини в
капілярних трубках.
1.6.2. Високотемпературні дослідження
1.6.2.1. Стержень розжарення Кофлера
Див. Додаток.
1.6.2.2. Мікроскоп для визначення температури плавлення
Див. Додаток.
1.6.2.3. Менісковий метод (поліаміди)
Див. Додаток.
Швидкість нагрівання до температури плавлення має бути менше
1 К/хв.
1.6.3. Методи визначення температури затвердіння
Див. Додаток.
1.6.4. Термічний аналіз
1.6.4.1. Диференціальний термічний аналіз
Див. Додаток.
1.6.4.2. Диференціальна скануюча калориметрія
Див. Додаток.
1.6.5. Визначення точки втрати текучості
Див. Додаток.
2. ДАНІ
В деяких випадках необхідне коригування даних термометра.
3. ЗВІТНІСТЬ
Звіт про результати дослідження, по можливості, включає
наступну інформацію:
- використана методика,
- точна специфікація речовини (особливості та домішки) та
попередні заходи очищення, якщо такі були,
- оцінка точності показників.
У якості температури плавлення вказується середнє значення
щонайменше двох вимірювань, що лежать у межах діапазону з
урахуванням похибки (див. таблиці).
Якщо різниця між температурою на початковому та кінцевому
етапі плавлення знаходиться в межах заданої точності методу,
температура кінцевого етапу плавлення приймається як температура
плавлення; в іншому випадку зафіксовуються обидва температурні
показники.
Якщо речовина розпадається або сублімується до досягнення
температури плавлення, слід вказати температуру, за якої
спостерігається таке явище.
Вся інформація та примітки, що стосуються пояснення
результатів, мають бути відображені в звіті, особливо щодо домішок
та фізичного стану речовини.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the
Council С(81) 30 final.
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B.Vodar, eds. Experimental
thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, p. 803-834.
(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry,
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience
Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of
reference materials from national laboratories, Pure and applied
chemistry, 1976, vol. 48, p. 505-515.

Додаток

Для отримання додаткових технічних даних можуть бути
використані, наприклад, наступні стандарти
1. Капілярні методи
1.1. Прилади з рідинною ванною для визначення температури
плавлення
ASTM E 324-69 Стандартний метод тестування для
відносної первинної та кінцевої точок,
а також для температурного діапазону
плавлення органічних хімічних речовин
BS 4634 Метод визначення точки плавлення та/або
температурного діапазону плавлення
DIN 53181 Визначення температурних інтервалів
плавлення смол за капілярним методом
JIS K 00-64 Методи тестування для визначення точки
плавлення хімічних продуктів
1.2. Прилади з металевим блоком для визначення температури
плавлення
DIN 53736 Візуальне визначення температури частково
кристалічних пластмас
ISO 1218 (E) Пластмаси - поліаміди - визначення
"точки плавлення"
2. Високотемпературні дослідження
2.1. Стержень розжарення Кофлера
ANSI/ASTM D 3451-76 Стандартні рекомендовані правила
тестування покриттів з полімерних
порошків
2.2. Мікроскоп для визначення температури плавлення
DIN 53736 Візуальне визначення температури частково
кристалічних пластмас
2.3. Менісковий метод (поліаміди)
ISO 1218 (E) Пластмаси - поліаміди - визначення
"точки плавлення"
ANSI\ASTM D 2133-66 Стандартна специфікація
для поліформальдегідних матеріалів
для виливання та штампування
NF T 51-050 Поліамідні смоли. Визначення
"точки плавлення" за методом меніску
3. Методи визначення температури затвердіння
BS 4633 Метод визначення точки кристалізації
BS 4695 Метод визначення точки плавлення
нафтового парафіну (Крива охолодження)
DIN 51421 Визначення точки замерзання авіаційного
палива, карбюраторного палива та
моторного бензолу
ISO 2207 Нафтовий віск: визначення температури
затвердіння
DIN 53175 Визначення точки затвердіння жирних
кислот
NF T 60-114 Точка плавлення парафінів
NF T 20-051 Метод визначення точки кристалізації
(точки затвердіння)
ISO 1392 Метод визначення точки затвердіння
4. Термічний аналіз
4.1. Диференціальний термічний аналіз
ASTM Е 537-76 Стандартні методи оцінки температурної
стійкості хімічних речовин методами
диференціального термічного аналізу
ASTM Е 473-85 Стандартні визначення термінів,
що стосуються термічного аналізу
ASTM Е 472-86 Стандартні правила фіксації даних
термічного аналізу
DIN 51005 Термічний аналіз, Поняття
4.2. Диференціальна скануюча калориметрія
ASTM Е 537-76 Стандартні методи оцінки температурної
стійкості хімічних речовин методами
диференціального термічного аналізу
ASTM Е 473-85 Стандартні визначення термінів,
що стосуються термічного аналізу
ASTM Е 472-86 Стандартні правила фіксації даних
термічного аналізу
DIN 51005 Термічний аналіз, Поняття
5. Визначення точки втрати текучості
NBN 52014 Відбір проб та аналіз нафтопродуктів:
температура помутніння та точка втрати
текучості
ASTM D 97-66 Стандартний метод тестування для
визначення точки втрати текучості
мінеральних масел
ISO 3016 Мінеральні масла - визначення точки
втрати текучості

А.2. ТЕМПЕРАТУРА КИПІННЯ
1. МЕТОДИКА
Більшість описаних методів ґрунтуються на Рекомендаціях ОЕСР
з тестування (1). Основні принципи наведені в посиланнях (2) та
(3).
1.1. ВСТУП
Описані методи та засоби можуть застосовуватися до рідких
речовин та таких, що мають низьку температуру плавлення, за умови,
що вони не піддаються хімічній реакції за температури нижчої, ніж
температура кипіння (наприклад, автоокислення, перегрупування,
розщеплення тощо). Методи можуть застосовуватися до рідких речовин
без обмежень стосовно ступеня їх чистоти.
Наголос зроблено на методах виявлення з допомогою
фотоелементів та термічному аналізі, оскільки ці методи дозволяють
визначення температур плавлення, а також кипіння. Крім того,
вимірювання можуть виконуватися автоматизовано.
"Динамічний метод" має ту перевагу, що він може бути
застосований для визначення пружності пари, при цьому
необов'язково коригувати температуру кипіння відносно нормального
тиску (101,325 кПа), оскільки нормальний тиск регулюється
маностатом під час вимірювання.
Примітки:
Вплив домішок на визначення температури кипіння великою мірою
залежить від характеру домішок. У випадку, якщо у зразку є летучі
домішки, що можуть вплинути на результати, речовина може
очищатися.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
Нормальна температура кипіння визначається як температура,
при якій пружність пари рідини становить 101,325 кПа.
Якщо температура кипіння вимірюється не при нормальному
атмосферному тиску, залежність температури від пружності пари може
бути описана рівнянням Клаузіуса-Клапейрона:
дельта H
v
log p = --------- 2,3RT
де:
p = пружність пари речовини в паскалях
-1
дельта H = її теплота пароутворення в Дж·моль
v
R = універсальна молярна газова константа =
-1 -1 8,314 Дж·моль ·К
T = термодинамічна температура в К
Температура кипіння вказується з урахуванням зовнішнього
тиску протягом вимірювання.
Перетворення:
Тиск (одиниці: кПа)
100 кПа = 1 бар = 0,1 МПа ("бар" ще дозволяється, але не рекомендується)
133 Па = 1 мм рт.ст. = 1 Торр (одиниці "мм рт.ст." та "Торр" не дозволяються)
1 атм = стандартна атмосфера = 101 325 Па (одиниця "атм" не дозволяється)
Температура (одиниці: К)
t = T - 273,15
t: температура за Цельсієм, градусів Цельсія (град.С)
T: абсолютна температура, Кельвіни (К)
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
При дослідженні будь-якої нової речовини немає потреби
застосовувати еталонні речовини. Головним чином, вони мають
слугувати для періодичної перевірки застосування методу, а також
порівняння з результатами, отриманими з інших методів.
Деякі калібрувальні речовини наведені в методах,
перерахованих у Додатку.
1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
П'ять методів визначення температури кипіння (температурного
діапазону кипіння) ґрунтуються на вимірюванні температури кипіння,
інші - на термічному аналізі.
1.4.1. Визначення з використанням ебуліометра
Ебуліометри спочатку були розроблені для визначення
молекулярної маси підвищенням температури кипіння, але вони також
підійшли для визначення точної температури кипіння. Дуже простий
прилад описано в стандарті ASTM D 1120-72 (див. Додаток). Рідина
нагрівається в цьому приладі за умови рівноваги при атмосферному
тиску до початку кипіння.
1.4.2. Динамічний метод
Характеристикою цього методу є вимірювання температури
повторної конденсації пари відповідним термометром в рефлюксі під
час кипіння. У цьому методі тиск може змінюватися.
1.4.3. Метод перегонки для температури кипіння
Характерними для цього методу є перегонка рідини та
вимірювання температури повторної конденсації пари, а також
визначення об'єму речовини для перегонки.
1.4.4. Метод Сиволобова
Зразок нагрівається в трубці для зразка, що занурюється в
рідину ванни з підігрівом. Запаяна капілярна трубка, що містить
повітряну бульбашку у нижній частині, опускається в трубку для
зразка.
1.4.5. Виявлення з допомогою фотоелементів
Відповідно до принципу застосування методу Сиволобова
здійснюється автоматичне фотоелектричне вимірювання з
використанням бульбашок, що піднімаються.
1.4.6. Диференціальний термічний аналіз
Цим методом фіксується різниця температур між речовиною та
еталонним матеріалом як функція температури під час того, як
речовина та еталонний матеріал піддаються однаковій
терморегулюючій програмі. Коли в зразку відбувається перехід, що
спричиняє зміну тепловмісту, ця зміна вказується ендотермічним
відхиленням (кипіння) від базової лінії температурних показників.
1.4.7. Диференціальна скануюча калориметрія
Цим методом фіксується різниця вхідної енергії речовини та
еталонного матеріалу як функція температури під час того, як
речовина та еталонний матеріал піддаються однаковій
терморегулюючій програмі. Ця енергія є енергією, необхідною для
встановлення нульової температурної різниці між речовиною та
еталонним матеріалом. Коли в зразку відбувається перехід, що
спричиняє зміну тепловмісту, ця зміна вказується ендотермічним
відхиленням (кипіння) від базової лінії показників теплового
потоку.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Застосовність та точність різних методів, що використовуються
для визначення температури кипіння/температурного діапазону
кипіння, вказуються в таблиці 1.
Таблиця 1
Порівняння методів
------------------------------------------------------------------ | Метод вимірювання | Передбачена точність | Існуючий стандарт | | | | | |---------------------+----------------------+-------------------| |Ебуліометр |+- 1,4 К (до 373 К) |ASTM D 1120-72(1) | | |(1) (2) | | | |+- 2,5 К (до 600 К) | | | |(1) (2) | | |---------------------+----------------------+-------------------| |Динамічний метод |+- 0,5 К (до 600 К)(2)| | |---------------------+----------------------+-------------------| |Процес перегонки |+- 0,5 К (до 600 К) |ISO/R 918, DIN | |(діапазон кипіння) | |53171, BS 4591/71 | |---------------------+----------------------+-------------------| |Відповідно до |+- 2 К (до 600 К)(2) | | |Сиволобова | | | |---------------------+----------------------+-------------------| |Виявлення з допомогою|+- 0,3 К (до 373 К)(2)| | |фотоелементів | | | |---------------------+----------------------+-------------------| |Диференціальний |+- 0,5 К (до 600 К) |ASTM E 537-76 | |термічний аналіз |+- 2,0 К (до 1 273 К) | | |---------------------+----------------------+-------------------| |Диференціальна |+- 0,5 К (до 600 К) |ASTM E 537-76 | |скануюча калориметрія|+- 2,0 К (до 1 273 К) | | ------------------------------------------------------------------
---------------- (1) Вказана точність дійсна лише для простого приладу, як,
наприклад, описано в ASTM D 1120-72; вона може бути підвищена за
рахунок удосконалених ебуліометричних приладів.
(2) Показники дійсні лише для чистих речовин. Використання за
інших умов має обґрунтовуватися.
1.6. ОПИС МЕТОДИК
Порядок проведення деяких методів тестування був описаний у
міжнародних та національних стандартах (див. Додаток).
1.6.1. Ебуліометр
Див. Додаток.
1.6.2. Динамічний метод
Див. метод тестування А.4 для визначення пружності пари.
Фіксується температура кипіння, що спостерігається при
застосуванні тиску в розмірі 101,325 кПа.
1.6.3. Процес перегонки (температурний діапазон кипіння)
Див. Додаток.
1.6.4. Метод Сиволобова
Зразок нагрівається у приладі для визначення температури
плавлення, в трубці для зразка діаметром близько 5 мм (малюнок 1).
На малюнку 1 показано тип стандартизованого приладу для
вимірювання температури плавлення та кипіння (JIS K 0064)
(виготовлено зі скла; всі специфікації вказані в міліметрах).

Малюнок 1
( 994_b14 )

У трубці для зразка розміщується капілярна трубка (трубка
кипіння), що спаяна на відстані близько 1 см над нижнім кінцем.
Рівень, на який додається тестова речовина, є таким, щоб спаяна
частина трубки знаходилася нижче рівня рідини. Трубка для зразка,
що містить капілярну трубку, кріпиться до термометра гумовою
стрічкою або фіксується збоку (див. малюнок 2).

Малюнок 2
( 994_b14 )

Малюнок 3
( 994_b14 )

Рідина в ванні обирається відповідно до температури кипіння.
Для температур до 573 К може використовуватися силіконове масло.
Вазелінове масло застосовується лише для температур не більше
473 К. Спочатку швидкість нагрівання рідини в ванні має бути
встановлена на рівні 3 К/хв. Рідину у ванні необхідно помішувати.
При температурі близько 10 К нижче очікуваної температури кипіння
швидкість нагрівання знижується таким чином, щоб вона становила
менше 1 К/хв. При наближенні до температури кипіння з капілярної
трубки починають швидко виділятися бульбашки.
Температура кипіння - це така температура, за якої, при
миттєвому охолодженні, потік бульбашок припиняється і по трубці
починає підніматися рідина. Відповідний показник термометра є
температурою кипіння речовини.
У модифікованому принципі (малюнок 3) температура кипіння
визначається у капілярній трубці для встановлення температури
плавлення. Вона витягується близько на 2 см в довжину (а), при
цьому всмоктується невелика кількість зразка. Відкритий кінець
потоншення закупорюється плавленням таким чином, щоб на кінці
розміщувалась невелика повітряна бульбашка. Під час нагрівання в
приладі для встановлення температури плавлення (b) повітряна
бульбашка розширюється. Температура кипіння відповідає
температурі, при якій закупорка в речовині досягає рівня поверхні
рідини в ванні (с).
1.6.5. Виявлення з допомогою фотоелементів
Зразок нагрівається в капілярній трубці всередині металевого
блоку з підігрівом.
Промінь світла спрямовується, через відповідні отвори в
блоці, крізь речовину на чітко калібрований фотоелемент.
Під час зростання температури зразка з капілярної трубки
з'являються поодинокі повітряні бульбашки. При досягненні
температури кипіння кількість повітряних бульбашок значно зростає.
Це спричиняє зміну інтенсивності світла, що фіксується
фотоелементом, та є сигналом зупинки для індикатора, який зчитує
температурні показники з платинового термометра опору,
розташованого в блоці.
Цей метод особливо корисний, оскільки він дозволяє визначення
температур нижчих кімнатної та до 253,15 К (- 20 град.С) без
будь-яких змін у приладі. Інструмент лише має занурюватися в ванну
для охолодження.
1.6.6. Термічний аналіз
1.6.6.1. Диференціальний термічний аналіз
Див. Додаток.
1.6.6.2. Диференціальна скануюча калориметрія
Див. Додаток.
2. ДАНІ
При малих відхиленнях від нормального тиску (макс. +- 5 кПа)
температури кипіння нормалізуються до T шляхом наступного
n рівняння Сіднея Янга для числових значень:
T = Т + (f · дельта p) n T
де:
дельта p = (101,325 - p) (зверніть увагу на знак)
Р = вимірювання тиску в кПа
f = ступінь зміни температури кипіння в залежності від тиску T в К/кПа
Т = виміряна температура кипіння в К
T = температура кипіння, скоригована відповідно до n нормального тиску в К
Коефіцієнти корекції температури, f , та рівняння для їх
T наближення, включено до міжнародних та національних стандартів,
вказаних вище для багатьох речовин.
Наприклад, у методі DIN 53171 вказуються наступні приблизні
показники корекції для розчинників, включаючи в лакофарбових
матеріалах:
Таблиця 2:
Температура - коефіцієнти корекції f
T
------------------------------------------------------------------ | Температура Т (К) | Коефіцієнт корекції f (К/кПа) | | | T | |-------------------------+--------------------------------------| | 323,15 | 0,26 | |-------------------------+--------------------------------------| | 348,15 | 0,28 | |-------------------------+--------------------------------------| | 373,15 | 0,31 | |-------------------------+--------------------------------------| | 398,15 | 0,33 | |-------------------------+--------------------------------------| | 423,15 | 0,35 | |-------------------------+--------------------------------------| | 448,15 | 0,37 | |-------------------------+--------------------------------------| | 473,15 | 0,39 | |-------------------------+--------------------------------------| | 498,15 | 0,41 | |-------------------------+--------------------------------------| | 523,15 | 0,4 | |-------------------------+--------------------------------------| | 548,15 | 0,45 | |-------------------------+--------------------------------------| | 573,15 | 0,47 | ------------------------------------------------------------------
3. ЗВІТНІСТЬ
Звіт про результати тестування, по можливості, включає
наступну інформацію:
- використана методика,
- точна специфікація речовини (особливості та домішки) та
попередні заходи очищення, якщо такі були,
- оцінка точності показників.
У якості температури кипіння вказується середнє значення
щонайменше двох вимірювань, що лежать у межах діапазону з
урахуванням похибки (див. таблицю 1).
Вказуються виміряні температури кипіння та їхнє середнє
значення, при цьому показник(и) тиску, що було використано для
вимірювань, наводиться в кПа. Бажано, щоб тиск був наближеним до
нормального атмосферного тиску.
Вся інформація та примітки, що стосуються пояснення
результатів, мають бути відображені в звіті, особливо щодо домішок
та фізичного стану речовини.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the
Council С(81) 30 final.
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B.Vodar, editions. Experimental
thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II.
(3) R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry,
Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience
Publications, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.

Додаток

Для отримання додаткових технічних даних можуть бути
використані, наприклад, наступні стандарти
1. Ебуліометр
1.1. Прилади з рідинною ванною для визначення температури
плавлення
ASTM D 1120-72 Стандартний метод тестування для
визначення точки кипіння антифризів
двигунів
2. Процес перегонки (температурний діапазон кипіння)
ISO/R 918 Метод тестування для перегонки (розмір
виходу та температурні межі відбору
фракцій)
BS 4349/68 Метод визначення перегонки нафтопродуктів
BS 4591/71 Метод визначення фракційного складу
DIN 53171 Розчинники для лакофарбових матеріалів,
визначення фракційного складу
NF T 20-608 Перегонка: визначення виходу та
температурного діапазону перегонки
3. Диференціальний термічний аналіз та диференціальна
скануюча калориметрія
ASTM Е 537-76 Стандартні методи оцінки температурної
стійкості хімічних речовин методами
диференціального термічного аналізу
ASTM Е 473-85 Стандартні визначення термінів, що
стосуються термічного аналізу
ASTM Е 472-86 Стандартні правила фіксації даних
термічного аналізу
DIN 51005 Термічний аналіз, Поняття

А.3. ВІДНОСНА ГУСТИНА
1. МЕТОДИКА
Описані методи ґрунтуються на Рекомендаціях ОЕСР з тестування
(1). Основні принципи наведені в посиланні (2).
1.1. ВСТУП
Описані методи для визначення відносної густини
застосовуються до твердих та рідких речовин, без будь-яких
обмежень стосовно ступеня їх чистоти. Різноманітні методи, що
можуть використовуватися, перераховані в таблиці 1.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
20
Відносна густина D твердих та рідких речовин є
4 співвідношенням між масою об'єму речовини, що має бути досліджена,
яка визначається при 20 град.С, та масою такого ж об'єму води, яка
визначається при 4 град.С. Відносна густина не має розмірності.
Густина, ро, речовини є співвідношенням маси, m, та її
об'єму, v.
Густина, ро, в системі одиниць CI вимірюється в кг/куб.м.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ (1) (3)
При дослідженні будь-якої нової речовини немає потреби
застосовувати еталонні речовини. Головним чином, вони мають
слугувати для періодичної перевірки застосування методу, а також
порівняння з результатами, отриманими з інших методів.
ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДІВ
1.4. Використовується чотири класи методів.
1.4.1. Методи на основі Архімедової сили
1.4.1.1. Гідрометр (для рідких речовин)
Достатньо точні та швидкі результати вимірювання можна
отримати через використання плаваючих гідрометрів, що дозволяють
вирахувати густину рідини з глибини занурення через показники
градуйованої шкали.
1.4.1.2. Гідростатичні терези (для рідких та твердих речовин)
Різниця між вагою тестового зразка, виміряною на повітрі та у
відповідній рідині (наприклад, воді), може бути використана для
визначення його густини.
У випадку твердих речовин виміряна густина є репрезентативною
лише для окремого застосованого зразка. Для визначення густини
рідин тіло відомого об'єму, v, спершу зважується на повітрі, а
потім - у рідині.
1.4.1.3. Метод занурення тіла (для рідких речовин) (4)
У цьому методі густина рідини визначається з різниці між
результатами зважування рідини до та після занурення тіла відомого
об'єму у тестову рідину.
1.4.2. Методи з застосуванням пікнометра
Для твердих або рідких речовин можуть застосовуватися
пікнометри різноманітних форм та з відомими об'ємами. Густина
вимірюється з різниці у вазі між повним і пустим пікнометром та
його відомим об'ємом.
1.4.3. Газопорівняльний пікнометр (для твердих речовин)
Густина твердої речовини будь-якої форми може вимірюватися
при кімнатній температурі газопорівняльним пікнометром. Об'єм
речовини вимірюється на повітрі або в інертному газі у циліндрі
змінного каліброваного об'єму. Для розрахунку густини вимірювання
маси проводиться після завершення вимірювання об'єму.
1.4.4. Осцилюючий денситометр (5) (6) (7)
Густина рідини може вимірюватися осцилюючим денситометром.
Механічний осцилятор, виготовлений у формі трубки U-подібної
форми, вібрує на резонансній частоті осцилятора, що залежить від
його маси. Введення зразка змінює резонансну частоту осцилятора.
Прилад має бути відкалібрований двома рідкими речовинами відомої
густини. Бажано відібрати такі речовини, щоб їхня густина
охоплювала діапазон, в межах якого знаходиться густина тестового
зразка.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Застосовність різних методів, що використовуються для
визначення відносної густини, наводиться в таблиці.
1.6. ОПИС МЕТОДІВ
У Додатку у якості прикладів наведено стандарти, які можуть
використовуватися для отримання додаткових технічних даних.
Тестування має проводитися при 20 град.С, при цьому має бути
виконано щонайменше два заміри.
2. ДАНІ
Див. стандарти.
3. ЗВІТНІСТЬ
Звіт про результати тестування, по можливості, включає
наступну інформацію:
- використана методика,
- точна специфікація речовини (особливості та домішки) та
попередні заходи очищення, якщо такі були.
20
Відносна густина, D , вказується таким чином, як
4 передбачено пунктом 1.2, разом з фізичним станом вимірюваної
речовини.
Вся інформація та примітки, що стосуються пояснення
результатів, мають бути відображені в звіті, особливо щодо домішок
та фізичного стану речовини.
Таблиця
Можливість застосування методів
------------------------------------------------------------------ | Метод | Густина | Максимально | Існуючі | | вимірювання |---------------------| можлива | стандарти | | | Тверда |Рідина| динамічна | | | | речовина | | в'язкість | | |--------------+--------------+------+-------------+-------------| |1.4.1.1. | | так | 5 Па с |ISO 387, | |Гідрометр | | | |ISO 649-2, | | | | | |NF T 20-050 | |--------------+--------------+------+-------------+-------------| |1.4.1.2. | так | так | 5 Па с |ISO 1183 (А) | |Гідростатичні | | | |ISO 901 та | |терези | | | |758 | |(a) тверді | | | | | |речовини | | | | | |(b) рідини | | | | | |--------------+--------------+------+-------------+-------------| |1.4.1.3. | | так | 20 Па с |DIN 53217 | |Метод | | | | | |занурення тіла| | | | | |--------------+--------------+------+-------------+-------------| |1.4.2. | так | так | 500 Па с |ISO 3507 | |Пікнометр | | | |ISO 1183(В) | |(a) тверді | | | |NF T 20-053 | |речовини | | | |ISO 758 | |(b) рідини | | | | | |--------------+--------------+------+-------------+-------------| |1.4.3. | так | | |DIN 55990 | |Газо- | | | |Розділ 3, | |порівняльний | | | |DIN 53243 | |пікнометр | | | | | |--------------+--------------+------+-------------+-------------| |1.4.4. | | так | 5 Па с | | |Осцилюючий | | | | | |денситометр | | | | | ------------------------------------------------------------------
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the
Council С(81) 30 final.
(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry,
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV,
Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976,
vol. 48, p. 508.
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte
von Flussigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. II,
p. 427-430.
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flussigkeiten,
Elektronik, 1970, vol. 19, p. 297-302.
(6) Baumgarten, D., Fullmengenkontrolle bei vorgepackten
Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei flussigen
Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische
Industrie, 1975, vol. 37, p. 717-726.
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im
Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, p. 253-255.

Додаток

Для отримання додаткових технічних даних можуть бути
використані, наприклад, наступні стандарти
1. Методи на основі Архімедової сили
1.1. Гідрометр
DIN 12790, ISO 387 Гідрометр, загальні інструкції
DIN 12791 Частина I: Гідрометри для вимірювання
густини; будова, налаштування
та використання
Частина II: Гідрометри для вимірювання
густини; стандартні розміри, призначення
Частина III: Використання та тестування
ISO 649-2 Лабораторний скляний посуд: Гідрометри
для вимірювання густини загального
призначення
NF T 20-050 Хімічні продукти для промислового
використання - Визначення густини рідин -
Аерометричний метод
DIN 12793 Лабораторний скляний посуд: Гідрометри
з визначенням діапазону показників
1.2. Гідростатичні терези
Для твердих речовин
ISO 1183 Метод А: Методи визначення густини та
відносної густини пластмас, за
виключенням пінопластів
NF T 20-049 Хімічні продукти для промислового
використання - Визначення густини твердих
речовин інших, ніж порошки та пористі
матеріали - Метод гідростатичних терезів
ASTM-D-792 Питома вага та густина пластмас через
витіснення
DIN 53479 Тестування пластмас та еластомерів;
визначення густини
Для рідких речовин
ISO 901 ISO 758
DIN 51757 Тестування мінеральних масел та суміжних
матеріалів; визначення густини
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 ASTM D 1481-62
ASTM D 1298 Густина, питома вага або густина в
градусах AHI для продуктів з неочищеної
нафти та рідких нафтопродуктів за
допомогою гідрометричного методу
BS 4714 Густина, питома вага або густина в
градусах AHI для продуктів з неочищеної
нафти та рідких нафтопродуктів за
допомогою гідрометричного методу
1.3. Метод занурення тіла
DIN 53217 Тестування фарб, лаків та подібних
матеріалів для покриття; визначення
густини; метод занурення тіла
2. Методи з застосуванням пікнометра
2.1. Для рідких речовин
ISO 3507 Пікнометри
ISO 758 Рідкі хімічні продукти; визначення
густини при температурі 20 град.С
DIN 12797 Пікнометр Гей-Люссака (для нелетучих
рідин, що не є занадто в'язкими)
DIN 12798 Пікнометр Липкіна (для рідин з
кінематичною в'язкістю менше
-6 -1
100 10 кв.м с при 15 град.С)
DIN 12800 Пікнометр Шпренгеля (для рідин,
передбачених DIN 12798)
DIN 12801 Пікнометр Рейсхауера (для рідин з
кінематичною в'язкістю менше
-6 -1
100 10 кв.м с при 20 град.С, що
застосовується, зокрема, також до
вуглеводнів і водних розчинів та
до рідин з вищою пружністю пари,
близько 1 бару при 90 град.С)
DIN 12806 Пікнометр Хаббарда (для в'язких рідин
всіх типів, для яких характерна невисока
пружність пари, а також, зокрема, для
фарб, лаків та бітумів)
DIN 12807 Пікнометр Бінгама (для рідин,
передбачених DIN 12801)
DIN 12808 Пікнометр Джолмеса (зокрема, для
етаноло-водної суміші)
DIN 12809 Пікнометр з прилаштованим термометром та
боковою капілярною трубкою (для рідин, що
не є занадто в'язкими)
DIN 53217 Тестування фарб, лаків та подібних
матеріалів; визначення густини
пікнометром
DIN 51757 Пункт 7: Тестування мінеральних масел та
суміжних матеріалів; визначення густини
ASTM D 297 Розділ 15: Гумові матеріали - хімічний
аналіз
ASTM D 2111 Метод С: Галогеновані органічні сполуки
BS 4699 Метод визначення питомої ваги та густини
нафтопродуктів (на основі використання
градуйованого бікапілярного пікнометра)
BS 5903 Метод визначення відносної густини та
густини нафтопродуктів з використанням
пікнометра, закритого капілярною трубкою
NF T 20-053 Хімічні продукти для промислового
використання - Визначення густини твердих
порошкоподібних речовин та рідин -
Пікнометричний метод
2.2. Для твердих речовин
ISO 1183 Метод В: Методи визначення густини та
відносної густини пластмас, за
виключенням пінопластів
NF T 20-053 Хімічні продукти для промислового
використання - Визначення густини твердих
порошкоподібних речовин та рідин -
Пікнометричний метод
DIN 19683 Визначення густини ґрунтів
3. Газопорівняльний пікнометр
DIN 55990 Тестування лакофарбових матеріалів та
подібних матеріалів для покриття;
Порошкові покриття; Визначення густини
DIN 53243 Лакофарбові матеріали; Хлористі полімери;
Тестування

А.4. ПРУЖНІСТЬ ПАРИ
1. МЕТОДИКА
Більшість описаних методів ґрунтуються на Рекомендаціях ОЕСР
з тестування (1). Основні принципи наведені в посиланнях (2) та
(3).
1.1. ВСТУП
Для проведення тестування доцільно мати попередню інформацію
про структуру, температуру плавлення та температуру кипіння
речовини.
Не існує єдиного методу вимірювання, що міг би
застосовуватися до всього діапазону показників пружності пари.
Проте деякі методи рекомендуються до застосування для вимірювання
-4 пружності пари в діапазоні від < 10 до 105 Па.
Зазвичай домішки впливають на показник пружності пари, при
цьому великою мірою це залежить від типу домішок.
Якщо у зразку містяться летучі домішки, які могли б вплинути
на результат вимірювання, речовина може очищатися. Також може бути
доцільним вказати пружність пари технічного матеріалу.
У деяких описаних далі методах використовується прилад з
металевими деталями; це має враховуватися при тестуванні
корозійно-активних речовин.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
Пружність пари речовини визначається як тиск насиченої пари
над твердою або рідкою речовиною. При термодинамічній рівновазі
пружність пари чистої речовини є лише функцією температури.
Одиницею пружності в системі CI, яка має використовуватися, є
паскаль (Па).
Одиниці, що використовувалися історично, разом з їхніми
перевідними коефіцієнтами, є такими:
2
1 Торр (= 1 мм рт.ст.) = 1,333 · 10 Па
5
1 атмосфера = 1,013 · 10 Па
5
1 бар = 10 Па

Одиницею температури в системі CI є кельвін (К).
-1 -1
Універсальна молярна газова константа R - 8,314 Дж·моль ·К
Залежність температури від пружності пари описується
рівнянням Клаузіуса-Клапейрона:
дельта H
v
log p = --------- + const. 2,3RT
де:
p = пружність пари речовини в паскалях
-1
дельта Н = її теплота пароутворення в Дж·моль
v
-1 -1
R = універсальна молярна газова константа в Дж·моль ·К
T = термодинамічна температура в К
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
При дослідженні будь-якої нової речовини немає потреби
застосовувати еталонні речовини. Головним чином, вони мають
слугувати для періодичної перевірки застосування методу, а також
порівняння з результатами, отриманими з інших методів.
1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДІВ ТЕСТУВАННЯ
Для визначення пружності пари пропонується сім методів, що
можуть застосовуватися у різноманітних діапазонах показників
пружності пари. У кожному з методів пружність пари визначається за
різних температур. В обмеженому температурному діапазоні логарифм
пружності пари чистої речовини є лінійною функцією, оборотною до
температури.
1.4.1. Динамічний метод
В динамічному методі вимірюється температура кипіння, що
відповідає вказаній пружності.
Рекомендований діапазон:
3 5
від 10 до 10 Па.
Цей метод також рекомендовано для визначення температури
кипіння за нормальних умов, при цьому він може застосовуватися з
цією метою для температури до 600 К.
1.4.2. Статичний метод
В статичному процесі, при термодинамічній рівновазі,
пружність пари, встановлена в закритій системі, визначається за
обумовленої температури. Цей метод підходить для одно- та
багатокомпонентних твердих і рідких речовин.
Рекомендований діапазон:
5
від 10 до 10 Па.
Цей метод може також використовуватися в межах діапазону від
1 до 10 Па, за умов дотримання безпеки.
1.4.3. Ізотенископ
Цей стандартизований метод є також статичним методом, але, як
правило, не підходить для багатокомпонентних систем. Додаткову
інформацію можна отримати в характеристиці методу ASTM D-2879-86.
Рекомендований діапазон:
5
від 100 до 10 Па.
1.4.4. Ефузіометричний метод: Вирівнювання тиску пари
В умовах вакууму визначається кількість речовини, що виходить
з камери за одиницю часу через отвір відомого розміру, при цьому
об'єм речовини, що повертається в камеру, незначний (наприклад,
шляхом вимірювання імпульсу, що генерується на чутливі терези
струменем пари, або вимірюванням зменшення ваги).
Рекомендований діапазон:
-3
від 10 до 1 Па.
1.4.5. Ефузіометричний метод: Через зменшення ваги або
вловлювання випаруваної речовини
Метод ґрунтується на оцінці маси тестової речовини, що
витікає за одиницю часу з камери Кнудсена (4) в формі пари через
мікроотвір за умов ультра-вакууму. Маса пари, що витекла, може
бути отримана або визначенням зменшення маси камери, або
конденсацією пари при низькій температурі та визначенням розміру
випаруваної речовини, застосувавши для цього хроматографічний
аналіз. Пружність пари розраховується з застосуванням формули
Герца-Кнудсена.
Рекомендований діапазон:
-3
від 10 до 1 Па.
1.4.6. Метод газонасичення
Потік інертного газу-носія пропускається через речовину таким
чином, що він насичується її парою. Кількість матеріалу, що
переноситься відомою кількістю газу-носія, вимірюється або
відбором у відповідний вловлювач, або з застосуванням аналітичних
методів. Цей матеріал далі використовується для розрахунку
пружності пари при заданій температурі.
Рекомендований діапазон:
-4
від 10 до 1 Па.
Цей метод може також використовуватися в межах діапазону від
1 до 10 Па, за умов дотримання безпеки.
1.4.7. Оборотний ротор
У вимірювачі оборотного ротора фактичним вимірювальним
елементом є невелика металева куля, що підвішена у магнітному полі
та обертається з високою швидкістю. Пружність газу визначається з
залежного від тиску уповільнення руху металевої кулі.
Рекомендований діапазон:
-4
від 10 до 0,5 Па.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Різноманітні методи визначення пружності пари різняться між
собою з огляду на можливість їх застосування, повторюваність,
відтворюваність, діапазон вимірювання, існуючі стандарти. Все це
наведено в наступній таблиці.
Таблиця:
Критерії якості
------------------------------------------------------------------------------------------- | Метод | Речовини | Очікувана | Очікувана |Рекомендований|Існуючий| | вимірювання |------------------|повторюваність|відтворюваність| діапазон |стандарт| | | Тверді |Рідини| (1) | (1) | | | | | речовини | | | | | | |---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------| |1.4.1. |легкоплавкі| так | До 25% | До 25% | 3 | - | |Динамічний | | | | |від 10 Па до | | |метод | | | | | 3 | | | | | | | |2 · 10 Па | | | | | | | | 3 | | | | | | 1-5% | 1-5% |від 2 · 10 Па| - | | | | | | | 5 | | | | | | | |до 10 Па | | |---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------| |1.4.2. | так | так | 5-10% | 5-10% |від 10 Па до |NFT 20- | |Статичний | | | | | 5 |048(5) | |метод | | | | |10 Па(2) | | |---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------| |1.4.3. | так | так | 5-10% | 5-10% | 2 |ASTM-D | |Ізотенископ | | | | |від 10 Па до |2879-86 | | | | | | | 5 | | | | | | | |10 Па | | |---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------| |1.4.4. | так | так | 5-20% | 5-50% | -3 |NFT 20- | |Ефузіометричний| | | | |від 10 Па до|047(6) | |метод: | | | | |1 Па | | |Вирівнювання | | | | | | | |тиску пари | | | | | | | |---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------| |1.4.5. | так | так | 10-30% | - | -3 | - | |Ефузіометричний| | | | |від 10 Па до| | |метод: Через | | | | |1 Па | | |зменшення ваги | | | | | | | |або вловлювання| | | | | | | |випаруваної | | | | | | | |речовини | | | | | | | |---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------| |1.4.6. Метод | так | так | 10-30% | До 50% | -4 | - | |газонасичення | | | | |від 10 Па до| | | | | | | |1 Па(2) | | |---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------| |1.4.7. | так | так | 10-20% | - | -4 | - | |Оборотний ротор| | | | |від 10 Па до| | | | | | | |0,5 Па | | -------------------------------------------------------------------------------------------
---------------- (1) В залежності від ступеня чистоти.
(2) Ці методи можуть також використовуватися в межах
діапазону від 1 до 10 Па, за умов дотримання безпеки.
1.6. ОПИС МЕТОДІВ
1.6.1. Динамічне вимірювання
1.6.1.1. Прилад
Прилад для вимірювання зазвичай складається з реактора,
сполученого з камерою охолодження, що виготовлена зі скла або
металу (мал. 1), обладнання для вимірювання температури і
обладнання для регуляції та вимірювання тиску. Типовий прилад для
вимірювання, показаний на малюнку, виготовляється з жаростійкого
скла та складається з п'яти частин:
Широка труба частково з подвійними стінками складається з
пришліфованого з'єднання з кожухом, охолоджувача, охолоджувальної
ємності та вхідного каналу.
Скляний циліндр, з насосом Котрела, вбудований у ту частину
труби, де відбувається кипіння, та має шорстку поверхню з
грануляту скла для уникнення сплесків при кипінні.
Температура вимірюється відповідним термодатчиком (наприклад,
термометром опору, ізольованою термопарою), зануреним у прилад до
точки вимірювання (N 5 на мал. 1) через відповідний отвір
(наприклад, пришліфоване з'єднання з зовнішньою різьбою).
Виконуються необхідні сполучення з обладнанням для регуляції
тиску та вимірювання.
Балон, що слугує для буферного об'єму, з'єднується з
вимірювальним приладом з допомогою капілярної трубки.
Ємність для випарювання нагрівається нагрівальним елементом
(наприклад, патронним нагрівачем), вмонтованим у скляний прилад
знизу. Необхідний тепловий потік подається та регулюється через
термопару.
2 5
Необхідний вакуум у межах між 10 Па та близько 10 Па
забезпечується вакуумним насосом.
Відповідна установка використовується для вимірювання повітря
або азоту з метою регуляції тиску (діапазон вимірювання становить
2 5 приблизно від 10 до 10 Па) та вентиляції.
Тиск вимірюється манометром.
1.6.1.2. Порядок проведення вимірювання
Пружність пари вимірюється шляхом визначення температури
кипіння зразка за різних обумовлених показників тиску в діапазоні
3 5 приблизно 10 - 10 Па. Стала температура за постійного тиску
вказує, що було досягнуто температури кипіння. Речовини, що
піняться, не можуть вимірюватися з використанням цього методу.
Речовина поміщається в чистий сухий посуд для проведення
дослідів. З не порошковими твердими речовинами може виникнути
проблема, але іноді її можна вирішити нагріванням охолоджувального
кожуха. Після наповнення ємності прилад запечатується на фланці і
речовина вакуумується. Далі встановлюється найнижчий передбачений
тиск і вмикається нагрівач. Водночас до самописця приєднується
термодатчик.
Рівновага досягається, коли фіксується постійна температура
кипіння при постійному тиску. Слід бути особливо обережним, щоб
уникнути "сплесків" при кипінні. Крім того, в охолоджувачі має
відбутися цілковита конденсація речовини. При визначенні пружності
пари легкоплавких твердих речовин слід бути обережним для
уникнення блокування конденсатора.
Після того, як була зафіксована точка рівноваги,
встановлюється більш високий тиск. Процес продовжується таким
5 чином до досягнення 10 Па (всього близько 5-10 точок
вимірювання). У якості контролю, точки рівноваги мають
повторюватися при зростаючих показниках тиску.
1.6.2. Статичне вимірювання
1.6.2.1. Прилад
Прилад складається з контейнера для зразка, нагрівальну та
охолоджувальну системи для регулювання температури зразка, а також
вимірювання температури. Прилад також включає інструменти для
встановлення та вимірювання тиску. На малюнках 2a та 2b
проілюстровані основні принципи, що застосовуються.
Камера для зразка (мал. 2а) розмежована з одного боку
відповідним високовакуумним клапаном. U-подібна трубка з належною
манометричною рідиною приєднана з іншого боку. Один кінець
U-подібної трубки відгалужується до вакуумного насоса, циліндра з
азотом або вентиляційного клапана, та до манометра.
Замість U-подібної трубки може бути використано вимірювач
тиску разом з індикатором тиску (мал. 2b).
З метою регуляції температури зразка посуд для зразка разом з
клапаном та U-подібною трубкою або вимірювачем тиску поміщається в
ванну, у якій витримується постійна температура з точністю
+- 0,2 К. Заміри температури проводяться на зовнішній стінці
ємності зі зразком або безпосередньо у цій ємності.
Вакуумний насос з вловлювачем висхідного потоку охолодження
використовується для вакуумування приладу.
У методі 2а пружність пари речовини вимірюється
опосередковано з використанням нульового індикатора. В цьому
випадку враховується той факт, що густина рідини в U-подібній
трубці змінюється при суттєвій зміні температури.
Наступні рідини підходять для використання в якості нульових
індикаторів для U-подібної трубки в залежності від діапазону
показників тиску та хімічних характеристик тестової речовини:
кремнійорганічні рідини, фталати. Тестова речовина не повинна бути
схильна до суттєвого розчинення в рідині U-подібної трубки або
вступати з нею в реакцію.
Для манометра може бути використана ртуть у діапазоні
2 показників нормального тиску повітря до 10 Па, тоді як
кремнійорганічні рідини та фталати можуть використовуватися при
2 показниках від 10 Па і нижче до 10 Па. Манометри з мембраною,
стійкою до нагрівання, можуть використовуватися навіть при
-1 показниках нижче 10 Па. Є також інші вимірювачі тиску, що можуть
2 використовуватися в умовах нижче 10 Па.
1.6.2.2. Порядок проведення вимірювання
Перед вимірюванням всі компоненти приладу, зображеного на
мал. 2, мають бути ретельно вимиті та висушені.
Для методу 2а наповніть U-подібну трубку обраною рідиною, що
має бути вакуумована при підвищеній температурі перед зніманням
показників.
Тестова речовина поміщається в прилад, який потім
закривається і температура знижується на рівень, достатній для
вакуумування. Температура має бути достатньо низькою для
забезпечення того, щоб повітря було висмоктане, але - у випадку
багатокомпонентної системи - вона не повинна змінювати склад
матеріалу. За необхідності рівновага може бути встановлена швидше
помішуванням.
Зразок може бути надмірно охолодженим, наприклад, рідким
азотом (слід вжити заходів для уникнення конденсації повітря або
робочої рідини насоса) або сумішшю етанолу та сухого льоду. Для
низькотемпературних вимірювань використовуйте ванну з регулятором
температури, з'єднану з ультракріостатом.
Клапаном над відкритим посудом для зразка протягом кількох
хвилин здійснюється вакуум-відсмоктування для видалення повітря.
Після цього клапан закривається і температура зразка знижується до
найнижчого передбаченого рівня. За необхідності операція з
вакуумування має бути повторена кілька разів.
При нагріванні зразка пружність пари зростає. Це змінює
рівновагу рідини в U-подібній трубці. Для корекції цього в прилад
через клапан подається азот або повітря до тих пір, доки рідина
індикатора тиску не повернеться на нульову відмітку. Тиск, що
вимагається для цього, може зчитуватися з високоточного манометра
при кімнатній температурі. Цей тиск відповідає пружності пари
речовини за такої окремої температури вимірювання.
Метод 2b є подібним, проте пружність пари зчитується
безпосередньо.
Температурна залежність пружності пари визначається за
належних невеликих інтервалів (всього близько 5-10 точок
вимірювання) до передбаченого максимуму. Низькотемпературні
показники мають повторюватися для контролю.
Якщо показники, отримані від повторюваних зчитувань, не
співпадають з кривою, отриманою для зростаючої температури, це
може бути наслідком одного з наступних випадків:
1. зразок все ще містить повітря (наприклад, високов'язкі
матеріали) або речовини, що закипають при низьких температурах,
які вивільняються протягом нагрівання і можуть бути видалені
висмоктуванням з подальшим переохолодженням;
2. температура охолодження недостатньо низька. В цьому
випадку рідкий азот використовується в якості охолоджувальної
речовини.
Якщо причиною є 1-ий або 2-ий випадок, вимірювання мають бути
повторені.
3. речовина зазнає хімічної реакції у досліджуваному
температурному діапазоні (наприклад, розпаду, полімеризації).
1.6.3. Ізотенископ
Повну характеристику цього методу можна знайти в посиланні 7.
принцип вимірювального приладу показаний на мал. 3. Подібно до
статичного методу, описаного в підпункті 1.6.2, ізотенископ
підходить для дослідження твердих речовин або рідин.
У випадку з рідинами речовина сама слугує робочою рідиною у
допоміжному манометрі. Кількість рідини, достатня для наповнення
балона та короткого плеча секції манометра, вводиться в
ізотенископ. Ізотенископ приєднується до вакуумної системи і з
нього відкачується повітря, потім наповнюється азотом.
Відкачування повітря та очистка системи повторюється двічі для
видалення залишків кисню. Наповнений ізотенископ розміщується
горизонтально таким чином, щоб зразок розтікався тонким шаром у
балоні для зразка та секції манометра (U-подібній частині). Тиск
системи знижується до 133 Па і зразок повільно нагрівається до тих
пір доки закипить (видалення розкладених постійних газів). Далі
ізотенископ розміщується таким чином, щоб зразок повернувся до
балону та короткого плеча манометра, щоб обидва були повністю
заповнені рідиною. Тиск утримується на такому рівні, який
передбачається для вакуумування; витягнутий кінець балона для
зразка нагрівається на малому вогні до того часу, доки вивільнена
пара зразка розширюється достатньо, щоб змістити частину зразка з
верхньої частини балона та плеча манометра в секцію манометра в
ізотенископі, створивши таким чином простір, наповнений парою та
вільний від азоту.
Потім ізотенископ поміщається в ванну з постійною
температурою, а тиск азоту регулюється таким чином, щоб він
дорівнював тиску зразка. Рівноважний тиск вказується манометричною
секцією ізотенископа. При рівновазі пружність пари азоту дорівнює
пружності пари речовини.
У випадку з твердими речовинами, в залежності від діапазону
тиску та температур, використовуються манометричні рідини,
перераховані в підпункті 1.6.2.1. Вакуумована робоча рідина
манометра додається в опуклу частину довгого плеча ізотенископа.
Далі тверда речовина, що має бути досліджена, поміщається в балон
і вакуумується при підвищеній температурі. Після цього ізотенископ
нахиляється таким чином, щоб робоча рідина манометра могла
витікати в U-подібну трубку. Вимірювання пружності пари як функції
температури проводиться відповідно до пункту 1.6.2.
1.6.4. Ефузіометричний метод: Вирівнювання тиску пари
1.6.4.1. Прилад
Різноманітні варіанти приладу описані в літературі (1).
Прилад, описаний тут, ілюструє загальний принцип виконання
(мал. 4). На малюнку 4 зображено основні компоненти приладу,
включаючи контейнер з високовакуумної нержавіючої сталі або скла,
обладнання для створення та вимірювання вакууму, а також вбудовані
компоненти для вимірювання пружності пари на терезах. До приладу
включено наступні вбудовані компоненти:
- Термокамера для випаровування з отвором, що обертається.
Термокамера для випаровування розроблена у формі циліндричної
ємності, виготовленої, наприклад, з міді або хімічно стійкого
сплаву з високою теплопровідністю. Може також застосовуватися
скляна ємність з мідною стінкою.
- Термокамера має діаметр близько 3-5 см та при цьому 2-5 см
висотою. В ній передбачено від одного до трьох отворів різного
розміру для потоку пари. Термокамера нагрівається з допомогою
спіралі розжарення, що розташовується навколо камери ззовні. Для
запобігання розсіюванню тепла на опорну плиту нагрівач
приєднується до опорної плити металом з низькою теплопровідністю
(нейзильбер або хромонікелева сталь), наприклад, труба з
нейзильберу приєднується до отвору, що обертається, якщо
використовується термокамера з кількома отворами. Таке обладнання
має перевагу в тому, що дозволяє використання мідної перемички. Це
дозволяє охолодження ззовні шляхом застосування ванни для
охолодження,
- якщо мідна кришка термокамери має три отвори різних
діаметрів під кутом 90 град. один до одного, в межах загального
діапазону вимірювання можуть бути задіяні різні діапазони
пружності пари (отвори діаметром між близько 0,30 та 4,50 мм).
Широкі отвори використовуються для низької пружності пари і
навпаки. Шляхом обертання термокамери може встановлюватися бажаний
отвір або проміжна позиція для потоку пари (отвір термокамери -
запобіжний екран - шалька терезів), при цьому потік молекул
вивільняється або проходить через отвір термокамери у шальку
терезів. З метою вимірювання температури речовини у відповідному
місці розміщується термопара або термометр опору,
- над захисним екраном знаходиться шалька високочутливих
терезів (див. нижче). Шалька терезів має діаметр близько 30 мм.
Гарним матеріалом для неї є позолочений алюміній,
- шалька терезів оточена циліндричним патроном або мідною
охолоджувальною камерою. Залежно від типу терезів вона має отвори
для балансира та отвір захисного екрана для потоку молекул, при
цьому вона має забезпечувати повну конденсацію пари на шальці
терезів. Розсіювання тепла ззовні забезпечується, наприклад,
мідною перемичкою, з'єднаною з охолоджувальною камерою. Перемичка
проходить через опорну плиту та теплоізольована від неї,
наприклад, трубкою з хромонікелевої сталі. Перемичка занурюється в
ємність Дюара з рідким азотом під опорною плитою або рідкий азот
циркулює через перемичку. При цьому охолоджувальна камера
утримується при температурі близько - 120 град.С. Шалька терезів
охолоджується окремо шляхом опромінення на рівні, достатньому для
діапазону показників пружності, що досліджується (охолодження
близько 1 години до початку вимірювання),
- терези розташовуються над охолоджувальною камерою. Такі
терези можуть бути високочутливими 2-плечними електронними
мікротерезами (8) або високочутливим магнітоелектричним
вимірювальним приладом (див. Рекомендацію ОЕСР з тестування 104,
видання від 12.05.1981 р.),
- опорна плита також передбачає електричні з'єднувачі для
термопар (або термометрів опору) та нагрівального приладу,
- вакуум створюється в посуді з допомогою низьковакуумного
або високовакуумного насоса (рівень вакууму, що вимагається,
-3 становить близько 1 -2 · 10 Па та отримується після 2 год.
Роботи насоса). Тиск регулюється відповідним іонним манометром.
1.6.4.2. Порядок проведення вимірювання
Посуд наповнюється тестовою речовиною і закривається кришка.
Захисний екран і охолоджувальна камера переміщуються в
термокамеру. Прилад закривається і вмикаються вакуумні насоси.
Остаточний тиск перед початком вимірювань має становити близько
-4 10 Па. Охолодження охолоджувальної камери починається при
-2 10 Па.
Після того, як було отримано необхідний рівень вакууму,
починайте серію калібрування за найнижчої з передбачених
температури. Встановлюється відповідний отвір у кришці, потік пари
проходить через захисний екран безпосередньо над отвором і
потрапляє в охолоджену шальку терезів. Шалька терезів має біти
достатньо великою, щоб забезпечити потрапляння до неї цілого
потоку, проведеного через захисний екран. Імпульс потоку пари діє
на шальку терезів і молекули конденсуються на її охолодженій
поверхні.
Імпульс та одночасна конденсація продукують сигнал на
самописець. Оцінка сигналів надає два типи інформації:
1. в описаному приладі пружність пари визначається
безпосередньо з імпульсу на шальці терезів (для цього немає
необхідності знати молекулярну масу (2)). При оцінці показників
мають братися до уваги такі геометричні фактори, як, наприклад,
кришка термокамери та кут молекулярного потоку;
2. одночасно з цим може бути виміряна маса конденсату та
звідси розрахована інтенсивність випаровування. Пружність пари
може також бути розрахована з інтенсивності випаровування та
молекулярної маси з допомогою рівняння Герца (2).
--------------- | 3 | 2 пі RT · 10 p = G _ |-------------- \| M

де:
-1 -2
G = інтенсивність випаровування (кг·с ·м )
-1
M = молярна маса (г·моль )
T = температура (К)
-1 -1
R = універсальна молярна газова константа (Дж·моль ·К )
p = пружність пари (Па)
Після того, як було досягнуто необхідного рівня вакууму,
серія вимірювань починається за найнижчої передбаченої температури
вимірювання.
При подальших вимірюваннях температура підвищується
невеликими інтервалами до досягнення максимального передбаченого
температурного показника. Далі зразок знову охолоджується і може
фіксуватися друга крива пружності пари. Якщо під час другого
заходу результати першого вимірювання не підтверджуються, це може
бути свідченням того, що при встановленому температурному
діапазоні речовина розкладається.
1.6.5. Ефузіометричний метод - через зменшення ваги
1.6.5.1. Прилад
Ефузійний прилад складається з наступних основних деталей:
- камера, що може бути термостатична та вакуумована і в якій
розміщуються ефузійні елементи,
- високовакуумний насос (наприклад, дифузійний або
турбомолекулярний насос) з вакуумметром,
- вловлювач, у якому застосовується розріджений азот або
сухий лід.
Алюмінієва вакуумна камера з електрообігрівачем та з чотирма
ефузійними елементами з нержавіючої сталі показана на мал. 5 для
зразка. Покриття з нержавіючої сталі товщиною близько 0,3 мм має
ефузійний отвір діаметром 0,2-1,0 мм і приєднується до ефузійного
елемента кришкою з різьбою.
1.6.5.2. Порядок проведення вимірювання
Еталонна та тестова речовини поміщаються в кожен з ефузійних
елементів, металева мембрана з виходом фіксується кришкою з
різьбою, кожен з елементів зважується з точністю до 0,1 мг.
Елемент поміщається в термостатний прилад, який далі вакуумується
до показника нижче одної десятої очікуваного тиску. За визначені
інтервали часу у діапазоні від 5 до 30 годин в прилад
пропускається повітря, при цьому переважуванням визначається
зниження маси ефузійного елемента.
З метою убезпечення результатів від впливу летучих домішок
елемент зважується у встановлені проміжки часу для перевірки того,
чи є сталою інтенсивність випаровування протягом щонайменше двох
таких проміжків часу.
Пружність пари р в ефузійному елементі визначається за
формулою:
---------- m | 2 пі RT p = ----- _ | -------- KA \| M t
де:
p = пружність пари (Па)
m = маса речовини, що залишає елемент за час t (кг)
t = час (с)
A = площа отвору (кв.м)
K = коефіцієнт корекції
-1 -1
R = універсальна молярна газова константа (Дж·моль ·К )
T = температура (К)
-1
M = молекулярна маса (г·моль )
Коефіцієнт корекції К залежить від відношення довжини до
радіуса циліндричного виходу:
------------------------------------------------------------------ |відношення |0,1 |0,2 |0,6 |1,0 |2,0 | |--------------+---------+---------+---------+---------+---------| |К |0,952 |0,909 |0,771 |0,672 |0,514 | ------------------------------------------------------------------
Вищенаведене рівняння можна записати наступним чином:
------ m | T p = E --- _ | --- t \| M

1 _ -------- де E = ---- \| 2 пі R і є константою ефузійного елемента. KA
Ця константа ефузійного елемента Е може бути вирахувана з
еталонними речовинами (2,9) за наступним рівнянням:
------ p(r)t | M(r) E = ------- _ | --- m \| T
де:
p(r) = пружність пари еталонної речовини (Па)
-1
M(r) = молекулярна маса еталонної речовини (кг·моль )
1.6.6. Метод газонасичення
1.6.6.1. Прилад
Типовий прилад для проведення цього тестування включає ряд
компонентів, наведених на мал. 6а, і описується нижче (1).
Інертний газ:
Газ-носій не повинен вступати в хімічну реакцію з тестовою
речовиною. Для цієї мети зазвичай достатньо азоту, але іноді може
вимагатися використання інших газів (10). Використовуваний газ має
бути сухим (див. мал. 6а, позначення 4 - датчик відносної
вологості).
Контроль потоку:
Для забезпечення постійного та обраного потоку через колону
насичення необхідна відповідна система контролю газу.
Вловлювачі для збирання пари:
Вони залежать від особливих характеристик зразка та обраного
методу аналізу. Пара має вловлюватися порціями та в такій формі,
яка б дозволяла подальший аналіз. Для деяких тестових речовин
можуть застосовуватися рідини-вловлювачі, наприклад, гексан або
етиленгліколь. Для інших можна використовувати абсорбенти у
твердій формі.
У якості альтернативи вловлюванню пари та подальшому аналізу,
для визначення кількості матеріалу, транспортованого відомою
кількістю газу-носія, можуть застосовуватися лінійні методи
аналізу, наприклад, хроматографія. Крім того, може бути виміряне
зниження маси зразка.
Теплообмінник:
Для вимірювань при різних температурах може бути необхідно
включити в систему теплообмінник.
Колона насичення:
Тестова речовина переноситься з розчину на відповідний
інертний носій. Покритий таким чином носій поміщається в колону
насичення, розміри якої та інтенсивність потоку мають бути такими,
щоб забезпечувалося цілковите насичення газу-носія. Колона
насичення має бути термостатована. Для вимірювань при температурі
вищій, ніж кімнатна, має нагріватися площина між колоною насичення
та вловлювачами для запобігання конденсації тестової речовини.
З метою зниження перенесення матеріалу, що відбувається через
дифузію, після колони насичення у систему може бути поміщена
капілярна трубка (мал. 6b).
1.6.6.2. Порядок проведення вимірювання
Підготовка колони насичення:
Розчин тестової речовини у легколетучому розчиннику додається
до відповідної кількості носія. Слід додати достатню кількість
тестової речовини для підтримки належного рівня насичення протягом
всього тестування. Розчинник повністю випаровується в повітрі або
в роторному випаровувачі і ретельно перемішаний матеріал додається
в колону насичення. Після термостатування зразка через апарат
пропускається сухий азот.
Вимірювання:
Вловлювачі або лінійний детектор приєднуються до вихідної
лінії колони і фіксується час. Інтенсивність потоку перевіряється
на початку та через рівні проміжки часу протягом експерименту з
допомогою вимірювача потоку бульбашок (або послідовно з
вимірювачем втрати маси).
Має вимірюватися тиск на виході до насичуючого апарату. Це
може бути зроблено або:
(a) включенням вимірювача тиску між насичуючим апаратом та
вловлювачами (цього може бути недостатньо, оскільки таким чином
збільшується мертва зона та абсорбуюча поверхня); або
(b) вимірюванням перепадів тиску в особливій системі
вловлювання, що використовуються як функція інтенсивності потоку в
окремо взятому експерименті (цей спосіб може не спрацювати у
випадку з рідинами-вловлювачами).
Час, що вимагається на збір такої кількості речовини, що
необхідна для різних методів аналізу, визначається попереднім
тестуванням або шляхом оцінювання. У якості альтернативи збору
речовини для подальшого аналізу може застосовуватися лінійний
кількісний метод аналізу (наприклад, хроматографія). Перед
проведенням розрахунку пружності пари за обумовленої температури
мають бути проведенні попередні тестування для визначення
максимальної інтенсивності потоку, за якої відбудеться цілковите
насичення газу-носія парою речовини. Це відбувається, якщо
газ-носій пропускається через насичуючий апарат достатньо повільно
таким чином, щоб ще менша інтенсивність не давала більш високого
показника пружності пари при розрахунках.
Вибір методу аналізу обумовлюється характеристиками речовини,
що має бути протестована (наприклад, газова хроматографія або
гравіметрія).
Визначається кількість речовини, що переноситься відомим
об'ємом газу-носія.
1.6.6.3. Розрахунок пружності пари
Пружність пари розраховується з густини пари, W/V, за такою
формулою:
W RT
p = --- x ---- V M
де:
p = пружність пари (Па)
W = маса випаруваної тестової речовини (г)
V = об'єм насиченого газу (куб.м)
-1 -1
R = універсальна молярна газова константа (Дж·моль ·К )
T = температура (К)
-1
M = молярна маса тестової речовини (г·моль )
Виміряні об'єми мають бути скориговані для різниць показників
тиску і температури між вимірювачем витрат матеріалу та
термостатичним насичуючим апаратом. Якщо вимірювач витрати
матеріалу розміщений за вловлювачем пари, може бути необхідне
коригування з метою врахування всіх складових випаруваного
вловлювача (1).
1.6.7. Оборотний ротор (8, 11, 13)
1.6.7.1. Прилад
Методика обладнання оборотного ротора може бути виконана з
використанням в'язкісного манометра ротора, як це показано на
мал. 8. Схема експериментальної установки зображена на мал. 7.
Вимірювальний прилад зазвичай складається з вимірювальної
головки ротора, розміщеної в термостатичній камері (регульованій з
точністю до 0,1 град.С). Контейнер зі зразком розміщується в
термостатичній камері (з температурою, відрегульованою до
0,01 град.С), а всі інші деталі обладнання піддаються дії високої
температури для уникнення конденсації. До системи через
високовакуумні клапани приєднується високовакуумний насос.
Вимірювальна головка оборотного ротора складається з
металевої кулі (діаметром 4-5 мм) у трубці. Куля підвішена та
тримається у магнітному полі, при цьому зазвичай використовується
комбінація постійних магнітів та регулюючих кілець.
Куля обертається завдяки магнітним полям, що формуються
кільцями. Приймаючі кільця, визначаючи завжди присутній слабкий
магнітний момент кулі, дозволяють вимірювати інтенсивність її
обертання.
1.6.7.2. Порядок проведення вимірювання
Після того, як куля досягає заданої швидкості обертання v(о)
(зазвичай близько 400 обертів за секунду), подальше приведення в
дію припиняється і відбувається сповільнення завдяки тертю газу.
Спад швидкості обертання вимірюється як функція часу.
Оскільки тертя, спричинене магнітним підвісом, несуттєве порівняно
з тертям газу, тиск газу р визначається за наступною формулою:
_
пі c r ро v(t)
p = --------- · ln ------ сигма 10t v(o)
де: _ c = середня швидкість молекул газу
r = радіус кулі
ро = масова густина кулі
сигма = коефіцієнт переносу тангенціального імпульсу
(епсилон = 1 для ідеальної сферичної поверхні кулі)
t = час
v(t) = швидкість обертання після часу t
v(o) = початкова швидкість обертання
Це рівняння можна записати наступним чином:
_ t - t
пі c r ро n n-1
p = --------- · --------- 10 сигма t · t
n n-1
де t , t - це показники часу, що вимагаються для заданої
n n-1 кількості N оборотів. Ці часові інтервали t та t йдуть
n n-1 послідовно один за одним, при цьому t > t .
n n-1
Середня швидкість молекули газу визначається за наступною
формулою:
1/2
_ 8RT
c = (-----) пі M
де:
T = температура
R = універсальна молярна газова константа
M = молярна маса
2. ДАНІ
Пружність пари у будь-якому з вищеописаних методів має
визначатися щонайменше для двох температур. Бажано, щоб було три
або більше в діапазоні від 0 до 50 град.С, з метою перевірки
лінійності кривої пружності пари.
3. ЗВІТНІСТЬ
Звіт про результати дослідження, по можливості, має включати
наступну інформацію:
- використана методика,
- точна специфікація речовини (особливості та домішки) та
попередні заходи очищення, якщо такі були,
- щонайменше два показники пружності пари та температури,
бажано в діапазоні від 0 до 50 град.С,
- всі вихідні дані,
- log p від кривої 1/Т,
- розрахунок пружності пари при 20 або 25 град.С.
Якщо спостерігається трансформація (зміна стану, розпад),
слід вказати наступну інформацію:
- характер зміни,
- температура, за якої відбувається зміна при атмосферному
тиску,
- пружність пари при 10 і 20 град.С нижче температури
трансформації та при 10 і 20 град.С вище цієї температури (крім
випадку, якщо відбувається перехід з твердого стану у
газоподібний).
Вся інформація та примітки, що стосуються пояснення
результатів, мають бути відображені в звіті, особливо щодо домішок
та фізичного стану речовини.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the
Council С(81) 30 final.
(2) Ambrose, D. in B. Le Neindre, B.Vodar, (Eds.):
Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II.
(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry,
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IX,
Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.
(4) Knudsen, M.Ann.Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911,
vol. 34, p. 593.
(5) NF T 20-048 AFNOR (September 85) Chemical products for
industrial use - Determination of vapour pressure of solids and
liquids within range from 10-1 to 105 Pa - Static method.
(6) NF T 20-047 AFNOR (September 85) Chemical products for
industrial use - Determination of vapour pressure of solids and
liquids within range from 10-3 to 1 Pa - Vapour pressure balance
method.
(7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour
pressure-temperature relationship and initial decomposition
temperature of liquids by isoteniscope.
(8) G.Messer, P.Rohl, G.Grosse and W.Jitschin. J.Vac.Sci.
Technol.(A), 1987, 'Vol. 5 (4), p. 2440.
(9) Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S.J.Chem.
Thermodynamics 1975, vol. 7, p. 1173.
(10) B.F.Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, p. 435.
(11) G.Comsa, J.K.Fremerey and B.Lindenau. J.Vac.Sci.
Technol. , 1980, vol. 17 (2), p. 642.
(12) G.Reich. J.Vac.Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4),
p. 1148.
(13) J.K.Fremerey. J.Vac.Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3),
p. 1715.

Додаток 1

Метод оцінки
ВСТУП
Розраховані показники пружності пари можуть
використовуватися:
- для вирішення того, який із експериментальних методів
підходить,
- для надання оціночної або граничної величини у випадках,
коли експериментальний метод не може бути застосований з технічних
причин (включаючи випадок, коли пружність пари дуже низька)
- щоб допомогти визначити випадки, коли випущення вимірювання
експериментальним шляхом є виправданим внаслідок того, що
-5 пружність пари, швидше за все, становить < 10 Па при кімнатній
температурі.
МЕТОД ОЦІНКИ
Пружність пари рідин та твердих речовин може оцінюватися
шляхом застосування модифікованої кореляції Уотсона (а). Єдиним
показником, отриманим експериментально, є точка кипіння за
нормальних умов. Метод застосовується у діапазоні показників
5 -5 пружності від 10 Па до 10 Па.
Детальна інформація про метод наведена в "Посібнику з методів
оцінки хімічних властивостей" (b).
ПОРЯДОК ПРОВЕДЕННЯ РОЗРАХУНКІВ
Відповідно до (b) пружність пари розраховується наступним
чином:
T m
(3 - 2 ---) Дельта H T
vb b T m-1 T ln P приблизно = ------------ (1 - ------------ - 2m(3 - 2 ---) ln ---) vp Дельта Z RT T T T b b ---- b b T
b
де:
Т = температура, що становить інтерес
Т = точка кипіння за нормальних умов b
P = пружність пари при температурі Т vp
Дельта H = теплота пароутворення
vb
Дельта Z = коефіцієнт стиснення (на рівні 0,97)
b
m = емпіричний коефіцієнт в залежності від фізичного стану
при температурі, що становить інтерес
звідси:
Дельта H
vb
----------- = K (8,75 + R ln T ) T F b
b
де K є емпіричним коефіцієнтом, що враховує полярність
F речовини. Для деяких типів сполук коефіцієнти K перераховані в
F посиланні (b).
Досить часто є доступними дані, у яких наводиться точка
кипіння при приведеному тиску. У такому випадку, відповідно до
(b), пружність пари розраховується наступним чином:
Дельта Hv T
1 T 1 T m-1 T
ln P приблизно = ln P + ------------- (1 - (3 - 2 ---) m --- - 2m (3 - 2 ---) ln ---) vp 1 Дельта Z RT T T T T b 1 1 1 1
де Т є точкою кипіння при приведеному тиску Р .
1 1
ЗВІТНІСТЬ
У випадку застосування методу оцінки звіт має включати повну
документацію стосовно проведення розрахунків.
ЛІТЕРАТУРА
(a) K.M.Watson, Ind.Eng.Chem., 1943, vol. 35, p. 398.
(b) W.J.Lyman, W.F.Reehl, D.H.Rosenblatt. Handbook of
Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Додаток 2

Малюнок 1
Прилад для визначення кривої пружності пари
за динамічним методом
( 994_b14 )

Малюнок 2а
Прилад для визначення
кривої пружності пари за статичним методом
(з використанням манометра з U-подібною трубкою)
( 994_b14 )

Малюнок 2b
Прилад для визначення
кривої пружності пари за статичним методом
(з використанням індикатора тиску)
( 994_b14 )

Малюнок 3
Ізотенископ (див. посилання 7)
( 994_b14 )

Малюнок 4
Прилад для визначення кривої пружності пари
за методом вирівнювання тиску пари
( 994_b14 )

Малюнок 5
Приклад апарату для випаровування
при низькому тиску за ефузіометричним методом
з об'ємом ефузійного елементу у 8 куб.см
( 994_b14 )

Малюнок 6а
Приклад системи регулювання потоку
для визначення пружності пари за методом газонасичення
( 994_b14 )

Малюнок 6b
Приклад системи для визначення пружності
пари за методом газонасичення, у якій капілярна трубка
розміщена після камери насичення
( 994_b14 )

Малюнок 7
Приклад експериментальної установки
для методу оборотного ротора
( 994_b14 )

Малюнок 8
Приклад вимірювальної головки оборотного ротора
( 994_b14 )

А.5. ПОВЕРХНЕВЕ НАТЯГНЕННЯ
1. МЕТОДИКА
Описані методи ґрунтуються на Рекомендаціях ОЕСР з тестування
(1). Основні принципи наведені в посиланні (2).
1.1. ВСТУП
Описані методи мають застосовуватися для вимірювання
поверхневого натягнення водних розчинів.
Перед проведенням тестування доцільно мати попередню
інформацію про розчинність у воді, структуру, характеристики
гідролізу та критичну концентрацію для міцелоутворення речовини.
Наступні методи застосовуються до більшості хімічних речовин,
без будь-яких обмежень стосовно ступеня їх чистоти.
Вимірювання поверхневого натягнення з використанням
кільцевого тензіометра обмежується водними розчинами з динамічною
в'язкістю, що становить менше, ніж близько 200 мПа·с.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
Ентальпія відкритої поверхні на одиницю площі поверхні
називається поверхневим натягненням.
Поверхневе натягнення приймається в:
Н/м (одиниця системи CI) або
мН/м (підодиниця системи CI)
1 Н/м = 103 дин/см
1 мН/м = 1 дин/см в застарілій системі одиниць СГС
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
При дослідженні будь-якої нової речовини немає потреби
застосовувати еталонні речовини. Головним чином, вони мають
слугувати для періодичної перевірки застосування методу, а також
порівняння з результатами, отриманими з інших методів.
Деякі калібрувальні речовини, що включають широкий діапазон
видів поверхневого натягнення, перераховані в посиланнях 1 та 3.
1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДІВ
Методи ґрунтуються на вимірюванні максимального зусилля, яке
має бути прикладене у вертикальній площині до підвісу або кільця,
що знаходиться у контакті з поверхнею досліджуваної рідини,
поміщеної в мірний посуд, з метою відділення його від поверхні
рідини, або до пластини, край якої контактує з поверхнею, з метою
витягування плівки, що утворилася.
Речовини, що розчиняються в воді щонайменше при концентрації
1 мг/л, тестуються у водному розчині з разовою концентрацією.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Ці методи можуть давати більш точні результати, ніж це
необхідно для оцінки впливу на навколишнє середовище.
1.6. ОПИС МЕТОДИК
Розчин речовини готується у дистильованій воді. Концентрація
цього розчину має становити 90% від максимально можливої
розчинності речовини у воді; якщо концентрація перевищує 1 г/л,
для тестування використовується концентрація у розмірі 1 г/л.
Речовини, що мають розчинність нижчу, ніж 1 мг/л, немає
необхідності піддавати тестуванню.
1.6.1. Метод пластинок
Див. ISO 304 та НФ Т 73-060 (Поверхнево-активні компоненти -
визначення поверхневого натягнення шляхом витягування плівки
рідини).
1.6.2. Метод підвісу
Див. ISO 304 та НФ Т 73-060 (Поверхнево-активні компоненти -
визначення поверхневого натягнення шляхом витягування плівки
рідини).
1.6.3. Метод кільця
Див. ISO 304 та НФ Т 73-060 (Поверхнево-активні компоненти -
визначення поверхневого натягнення шляхом витягування плівки
рідини).
1.6.4. Метод кільця, погоджений ОЕСР
1.6.4.1. Прилад
Для цього вимірювання підходять тенсіометри, доступні в
продажу. Вони складаються з наступних елементів:
- переносний стіл для зразка,
- система вимірювання сили,
- вимірний елемент (кільце),
- посуд для проведення вимірів.
1.6.4.1.1. Переносний стіл для зразка
Переносний стіл для зразка використовується як штатив для
посуду з можливістю температурного контролю, в якому проводиться
дослідження рідини. Що має бути піддана тестуванню. Він монтується
на стенді разом з системою вимірювання сили.
1.6.4.1.2. Система вимірювання сили
Система вимірювання сили (див. малюнок) розміщується над
столом для зразка. Похибка у вимірюванні сили не повинна
-6 перевищувати +- 10 Н, що відповідає можливій похибці в межах
+- 0,1 мг в вимірюванні маси. У більшості випадків шкали
вимірювання тенсіометрів, що знаходяться в продажу, калібровані в
мН/м таким чином, щоб поверхневе натягнення могло бути прочитано
безпосередньо в мН/м з точністю до 0,1 мН/м.
1.6.4.1.3. Вимірний елемент (кільце)
Кільце зазвичай виготовляється з платиново-іридієвого дроту
близько 0,4 мм товщиною та з середньою окружністю 60 мм. Кільце з
дроту підвішується горизонтально з металевого гвинта та каркаса з
дроту, що слугує для з'єднання з системою вимірювання сили (див.
малюнок).
Малюнок
Вимірний елемент
( 994_b14 )

1.6.4.1.4. Посуд для проведення вимірів
Посуд для проведення вимірів, в якому утримується розчин для
тестування, що має бути виміряний, - це скляний посуд з можливістю
контролю температури. Він виготовлений таким чином, щоб під час
проведення вимірів температура розчину рідини, що тестується, а
також газова фаза над його поверхнею залишалися сталими та щоб
зразок не міг випаруватися. Допускається циліндричний скляний
посуд з внутрішнім діаметром не менше 45 мм.
1.6.4.2. Підготовка приладу
1.6.4.2.1. Очищення
Скляний посуд має бути чисто вимитий. За необхідності його
можна вимити гарячою хромо-сульфатною кислотою, а потім густою
фосфорною кислотою (83-98% ваги Н РО ), ретельно прополоскати в
3 4 проточній воді та наостанок промити в дистиляті подвійної
перегонки, доки не буде отримано нейтральну реакцію, а потім
просушити або сполоснути рідиною зі зразка, що має вимірюватися.
Кільце спочатку має бути ретельно промите у воді для
видалення будь-яких речовин, що можуть бути розчинними у воді,
ненадовго опущене в хром-сульфатну кислоту, промите в дистиляті
подвійної перегонки, доки не буде отримано нейтральну реакцію, а
наостанок нагріте короткочасним утриманням над полум'ям від
метанолу.
Примітка:
Забруднення речовинами, які не розчиняються та не руйнуються
під впливом хром-сульфатної кислоти, наприклад, кремнійорганічні
сполуки, видаляються за допомогою відповідних органічних
розчинників.
1.6.4.2.2. Калібрування приладу
Атестування приладу складається з перевірки нульової точки та
налаштування її таким чином, щоб показники інструменту дозволяли
отримати достовірне визначення в мН/м.
Монтаж:
Прилад урівноважується, наприклад, спиртовим рівнем в основі
тензіометра, шляхом регулювання установочних гвинтів в основі.
Налаштування нульової точки
Після при ладнання кільця до приладу та перед зануренням у
рідину необхідно налаштувати показник тензіометра на нуль та
перевірити кільце на розташування його паралельно до поверхні
рідини. Для цієї цілі поверхня рідини може бути використана в
якості дзеркала.
Калібрування:
Калібрування для даного тесту може бути виконане однією з
двох наступних процедур:
(а) З використанням маси: шляхом використання гир відомої
маси між 0,1 та 1,0 г, що розміщуються на кільці. Коефіцієнт
калібрування Ф , на який мають множитися всі показники
а
інструмента, визначається за наступним рівнянням (1).
сигма
r
Ф = ------ а сигма
a
де:
mg
сигма = ---- (мН/м) r 2b
m = маса гирі (г)
-2
g = гравітаційне прискорення (981 см·с на рівні моря)
b = середня окружність кільця (см)
сигма = показник тензіометра після поміщення гирі в кільце
a (мН/м).
(b) З використанням води: шляхом використання чистої води,
поверхневе натягнення якої, наприклад, при 23 град.С дорівнює
72,3 мН/м. Ця процедура виконується швидше, ніж калібрування за
масою, але завжди є ризик, що показник поверхневого натягнення
води буде викривлений внаслідок слідів забруднення
поверхнево-активними речовинами.
Коефіцієнт калібрування Ф , на який мають множитися всі
b показники інструмента, визначається за наступним рівнянням (2):
сигма
0
Ф = ------ b сигма
g
де:
сигма = офіційно встановлений показник поверхневого
0 натягнення води (мН/м)
сигма = виміряний показник поверхневого натягнення води
g (мН/м), при цьому обидва визначаються за однакової температури.
1.6.4.3. Підготовка зразків
Водні розчини готуються з речовин, що мають проходити
тестування, з застосуванням належних концентрацій у воді, та при
цьому не містити будь-яких нерозчинних речовин.
Розчин має підтримуватися при сталій температурі
(+- 0,5 град.С). Оскільки поверхневе натягнення розчину в посуді
для вимірювання з часом змінюється, у різний час має бути
проведено кілька вимірів та побудовано криву, що б відображала
поверхневе натягнення як функцію часу. Якщо більше не відбувається
змін, це означає, що досягнуто стану рівноваги.
Пилове та газове забруднення іншими речовинами заважає
вимірам. Тому робота проводиться під захисним покриттям.
1.6.5. Умови тестування
Вимірювання проводиться при температурі близько 20 град.С та
має утримуватися в межах відхилення +- 0,5 град.С.
1.6.6. Проведення тестування
Розчини для вимірювання переливаються в ретельно вимитий
посуд для вимірювання, при цьому необхідно слідкувати, щоб не було
піни, а потім посуд з розчином поміщається стіл тестового приладу.
Дека стола з посудом для вимірювання піднімається до тих пір, доки
кільце не зануриться в розчин, що тестується. Далі дека стола
поступово рівномірно опускається (зі швидкістю близько 0,5 см/хв.)
для відриву кільця від поверхні, доки не буде досягнуто
максимальної сили. Шар рідини, що тягнеться за кільцем, не повинен
відділятися від кільця. Після завершення вимірів, кільце знову
занурюється в розчин і виміри проводяться повторно до тих пір,
доки не буде досягнуто сталого показника поверхневого натягнення.
Для кожного такого визначення має вказуватися час від моменту
переливання розчину в посуд для дослідів. Показники беруться для
максимальної сили, що вимагається для відривання кільця від
поверхні рідини.
2. ДАНІ
Для того, щоб вирахувати поверхневе натягнення, значення
отриманого на приладі показника у мН/м, перш за все, має бути
помножене на фактор калібрування Ф або Ф (в залежності від
а b процедури калібрування, що застосовується). Це дасть показник, що
має лише приблизне значення та потребує внесення поправок.
Гаркінс та Джордан (4) емпірично визначили коефіцієнти
поправки для значень поверхневого натягнення, виміряних методом
кільця, що залежать від розміру кільця, густини рідини та її
поверхневого натягнення.
Оскільки визначення коефіцієнтів поправки для кожного
окремого виміру з таблиць Гаркінса-Джордана є досить трудомістким,
з метою розрахунку поверхневого натягнення для водних розчинів
може застосовуватися спрощена процедура зчитування показників
поверхневого натягнення безпосередньо з таблиці. (Для даних, що
знаходяться в діапазоні між показниками таблиці, застосовується
інтерполяція).
Таблиця:
Поправка виміряного поверхневого натягнення
Лише для водних розчинів, с = 1 г/куб.см
------------------------------------------------------------------ |r |= 9,55 мм (середній радіус кільця) | |---------------+------------------------------------------------| |r |= 0,185 мм (радіус дроту кільця) | ------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------ | Значення, отримане | Значення з поправкою (мН/м) | | при експерименті |------------------------------------------| | (мН/м) |Калібрування за вагою| Калібрування за | | | (див. 1.6.4.2.2(а)) | водою (див. | | | | 1.6.4.2.2(b)) | |---------------------+---------------------+--------------------| | 20 | 16,9 | 18,1 | | 22 | 18,7 | 20,1 | | 24 | 20,6 | 22,1 | | 26 | 22,4 | 24,1 | | 28 | 24,3 | 26,1 | | 30 | 26,2 | 28,1 | | 32 | 28,1 | 30,1 | | 34 | 29,9 | 32,1 | | 36 | 31,8 | 34,1 | | 38 | 33,7 | 36,1 | | 40 | 35,6 | 38,2 | | 42 | 37,6 | 40,3 | | 44 | 39,5 | 42,3 | | 46 | 41,4 | 44,4 | | 48 | 43,4 | 46,5 | | 50 | 45,3 | 48,6 | | 52 | 47,3 | 50,7 | | 54 | 49,3 | 52,8 | | 56 | 51,2 | 54,9 | | 58 | 53,2 | 57,0 | | 60 | 55,2 | 59,1 | | 62 | 57,2 | 61,3 | | 64 | 59,2 | 63,4 | | 66 | 61,2 | 65,5 | | 68 | 63,2 | 67,7 | | 70 | 65,2 | 69,9 | | 72 | 67,2 | 72,0 | | 74 | 69,2 | - | | 76 | 71,2 | - | | 78 | 73,2 | - | ------------------------------------------------------------------
Ця таблиця була складена на базі поправок Гаркінса-Джордана.
Вона подібна до таблиці Стандартів від Німецького інституту
стандартів (DIN 53914) для води та водних розчинів (густина
с = 1 г/куб.см, при цьому застосовується для доступних у продажу
кілець з розмірами R = 9,55 мм (середній радіус кільця) та
r = 0,185 мм (радіус дроту кільця). В таблиці наведено поправки
для значень поверхневого натягнення, виміряних після калібрування
з допомогою гир або за водою.
Як альтернативний варіант, можливий розрахунок поверхневого
натягнення без попереднього калібрування за наступною формулою:
f + F
сигма = ------- 4 пі R
де:
F = сила, виміряна динамометром на точці розриву плівки
R = радіус кільця
f = коефіцієнт поправки (1)
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про результати дослідження, по можливості, має включати
наступну інформацію:
- використана методика,
- тип застосованої води або розчину,
- точна специфікація речовини (особливості та домішки),
- результати вимірювання: поверхневе натягнення (показник),
при цьому вказуються як індивідуальні показники, так і їхнє
середньоарифметичне значення, а також скориговане середнє значення
(з урахуванням похибки інструмента та таблиці поправок),
- концентрація розчину,
- температура тестування,
- вік використовуваного розчину; зокрема, час між
приготуванням та проведенням вимірювання,
- опис часової залежності поверхневого натягнення після
переливання розчину в посуд для вимірів,
- вся інформація та примітки, що стосуються пояснення
результатів, мають бути відображені в звіті, особливо щодо домішок
та фізичного стану речовини.
3.2. ПОЯСНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Прийнявши, що дистильована вода має поверхневе натягнення
72,75 мН/м при 20 град.С, речовини, поверхневе натягнення яких
становить менше 60 мН/м, в умовах цього методу мають розглядатися
як поверхнево-активні матеріали.
4. ПОСИЛАННЯ
(14) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the
Council С(81) 30 final.
(15) R.Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry,
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience
Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV.
(16) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511.
(17) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930,
vol. 52, p. 1751.

А.6. РОЗЧИННІСТЬ У ВОДІ
1. МЕТОДИКА
Описані методи ґрунтуються на Рекомендаціях ОЕСР з тестування
(1).
1.1. ВСТУП
Перед проведенням тестування доцільно мати попередню
інформацію про структурну формулу, пружність пари, константу
дисоціації та характеристики гідролізу (як функцію рН) речовини.
Не існує єдиного методу, що був би ефективним для всіх видів
розчинності у воді.
Два методи тестування, описані нижче, покривають всі види
розчинності, але не застосовуються до летучих речовин:
- один застосовується до головним чином хімічно чистих
-2 речовин з низьким ступенем розчинності (< 10 грама на літр),
стійких у воді, і має назву "метод елюювання",
- інший застосовується до головним чином хімічно чистих
-2 речовин з вищим ступенем розчинності (> 10 грама на літр),
стійких у воді, і має назву "метод колби".
На розчинність у воді речовини, призначеної для тестування,
може серйозно впливати присутність домішок.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
Розчинність речовини у воді визначається масовою
концентрацією насичення речовини у воді при заданій температурі.
Розчинність у воді наводиться в одиницях маси на об'єм розчину.
Одиницею в системі CI є кг/куб.м (також можуть використовуватися
грами на літр).
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
При дослідженні будь-якої нової речовини немає потреби
застосовувати еталонні речовини. Головним чином, вони мають
слугувати для періодичної перевірки застосування методу, а також
порівняння з результатами, отриманими з інших методів.
1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Приблизна кількість зразка та час, необхідний для досягнення
масової концентрації насичення, має визначатися простим попереднім
тестуванням.
1.4.1. Метод елюювання
Цей метод ґрунтується на елююванні речовини, що тестується, з
водою з мікроколони, наповненої інертним допоміжним матеріалом,
наприклад, скляними гранулами або піском, покритим надмірною
кількістю речовини, що тестується. Розчинність у воді
встановлюється, коли масова концентрація елюенту є сталою. Це
підтверджується плато концентрації як функцією часу.
1.4.2. Метод колби
У цьому методі речовина (тверді тіла мають бути подрібнені)
розчиняється у воді при температурі дещо вищій, ніж температура
тестування. Після досягнення насичення суміш охолоджується та
витримується в температурі тестування, при цьому її необхідно
перемішати до досягнення однорідної маси. Як альтернативний
варіант, вимірювання може проводитись безпосередньо при
температурі тестування, якщо відповідною пробою буде забезпечено
досягнення однорідності насичення. Внаслідок цього масова
концентрація речовини у водному розчині, що не повинен містити
жодних нерозчинних часток, визначається належним аналітичним
методом.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
1.5.1. Повторюваність
Для методу елюювання може отримуватися < 30%; для методу
колби має бути витримано < 15%.
1.5.2. Чутливість
Це залежить від методу аналізу, але масові концентрації,
-6 нижчі за 10 г/л, можуть бути визначені.
1.6. ОПИС МЕТОДИКИ
1.6.1. Умови тестування
Бажано проводити тестування при температурі 20 +- 0,5 град.С.
Якщо є підозра, що температура залежить від розчинності (> 3% на
град.С), мають також застосовуватися два інші температурні
показники щонайменше на 10 град.С вище та нижче первинно
встановленої температури. У цьому випадку температурний контроль
має бути в межах +- 0,1 град.С. Обрана температура має постійно
підтримуватися в усіх відповідних деталях обладнання.
1.6.2. Попереднє тестування
До близько 0,1 г зразка (тверді речовини мають бути
подрібнені) у мірному циліндрі на 10 мл з притертою пробкою
додається дистильована вода в об'ємах, що поступово збільшуються,
при кімнатній температурі відповідно до етапів, наведених у
таблиці нижче:
------------------------------------------------------------------ | 0,1 г | 0,1 | 0,5 | 1 | 2 | 10 | 100 |> 100| | розчинний | | | | | | | | | y'x' | | | | | | | | | мл води | | | | | | | | |-----------+-------+-------+-------+-------+-------+------+-----| |Приблизна |> 1 000|1 000- |200-100|100-50 | 50-10 | 10-1 | < 1 | |розчинність| |200 | | | | | | |(грами на | | | | | | | | |літр) | | | | | | | | ------------------------------------------------------------------
Після кожного додавання вказаної кількості води суміш
енергійно збовтується протягом 10 хвилин і візуально перевіряється
на присутність будь-яких нерозчинених часток зразка. Якщо після
додавання 10 мл води зразок або його частки залишаються
нерозчиненими, експеримент має бути повторено у мірному циліндрі
на 100 мл з більшими об'ємами води. При нижчому рівні розчинності
час, що вимагається на розчинення речовини, може бути суттєво
довшим (має дозволятися принаймні 24 години). Приблизний рівень
розчинності наведений у таблиці під показниками об'єму доданої
води, у якій відбувається повне розчинення зразка. Якщо речовина
залишається очевидно нерозчиненою, може бути дозволено більше
24 годин (максимально 96 годин) або застосовується подальше
розбавлення з метою отримання свідчення того, чи має
застосовуватися для розчинення метод елюювання або метод колби.
1.6.3. Метод елюювання
1.6.3.1. Допоміжний матеріал, розчинник та елюент
Допоміжний матеріал для методу елюювання має бути інертним.
Прикладом матеріалів, які можуть бути використані, є скляні
гранули та пісок. Для застосування тестової речовини на
допоміжному матеріалі має застосовуватися відповідний летучий
розчинник з якістю аналітичного реагенту. У якості елюенту
застосовується вода, що двічі переганялася у скляному чи
кварцовому апараті.
Примітка:
Не повинна використовуватися вода безпосередньо з органічного
іонообмінного фільтра.
1.6.3.2. Завантаження допоміжного матеріалу
Близько 600 мг допоміжного матеріалу зважується та
переміщується в колбу з круглим дном на 50 мл.
Відповідна зважена кількість тестової речовини розчиняється в
обраному розчиннику. Належна кількість цього розчину додається до
допоміжного матеріалу. Розчинник має бути повністю випаруваний,
наприклад, у роторному випарнику; інакше насичення допоміжного
матеріалу водою не буде досягнуто внаслідок ефекту розмежування на
поверхні допоміжного матеріалу.
Завантаження допоміжного матеріалу може спричинити проблеми
(помилкові результати), якщо тестова речовина осідає у вигляді
олії чи в іншій фазі кристалізації. Ця проблема має бути
експериментально досліджена, про що складається звіт.
Дозволяється, щоб завантажений допоміжний матеріал
замочувався протягом двох годин приблизно в 5 мл води, а потім ця
суспензія додається в мікроколону. Як варіант, сухий завантажений
допоміжний матеріал може засипатися в мікроколону, що перед цим
наповнюється водою, після чого залишається в такому стані близько
двох годин.
Порядок тестування:
Відділення речовини від допоміжного матеріалу може
проводитися одним із двох різних способів:
- рециркуляційний насос (див. малюнок 1),
- рівноважний посуд (див. малюнок 4).
1.6.3.3. Метод елюювання з рециркуляційним насосом
Прилад
Схема розміщення типової системи представлена на мал. 1.
Відповідна мікроколона показана на мал. 2, хоча прийнятним є
будь-який розмір за умови, що він відповідає критеріям
відтворюваності та чутливості. В колоні має бути місце для
щонайменше п'яти об'ємів шарів води, при цьому вона має бути
здатна утримувати мінімум п'ять зразків. Як варіант, розмір може
бути зменшено, якщо замість первинних п'яти об'ємів шарів,
використовується розчинник, очищений від домішок.
Колона має бути приєднана до рециркуляційного насоса,
здатного контролювати потоки об'ємом близько 25 мл/год. Насос
приєднаний політетрафторетиленовими (ПТФЕ) та/або скляними
з'єднувальними патрубками. Колона та насос, з'єднуючись, повинні
мати резерв для відбору відходів та забезпечення у вільному місці
атмосферного тиску. Матеріал колони супроводжується невеликою
(5 мм) пробкою зі скловати, що одночасно слугує для фільтрування
часток. Рециркуляційний насос може бути, наприклад, шланговим або
мембранним (необхідно слідкувати за тим, щоб не трапилося
забруднення та/або абсорбції матеріалу труби).
Порядок проведення вимірів
Через колону запускається потік. Рекомендується
використовувати потік об'ємом 25 мл/год. (такий об'єм відповідає
проходженню 10 об'ємів шарів за годину для описаної колони). Перші
п'ять об'ємів шарів (мінімум) відкидаються з метою видалення
розчинних у воді домішок. Після цього рециркуляційний насос працює
до тих пір, доки не буде досягнуто рівноваги, визначеної за
п'ятьма зразками, концентрація яких не відрізняється більш ніж на
+- 30% у випадковій послідовності. Ці зразки мають бути відділені
один від одного часовими проміжками, що відповідають проходженню
щонайменше 10 об'ємів шарів елюенту.
1.6.3.4. Метод елюювання з рівноважним посудом
Прилад (див. малюнки 4 та 3)
Рівноважний посуд: з'єднання з рівноважним посудом
здійснюється через використання скляного шліфу, приєднаного
політетрафторетиленовими з'єднувальним патрубком. Рекомендується
використовувати потік об'ємом близько 25 мл/год. Відділені частки
мають бути зібрані та проаналізовані за обраним методом.
Порядок проведення вимірів
Ці частки, зібрані з елюату середнього рівня, де концентрація
постійна (+- 30%) щонайменше у п'яти послідовних відборах,
використовуються для визначення розчинності у воді.
В обох випадках (з використанням рециркуляційного насосу або
рівноважного посуду) має бути проведено другий пробіг експерименту
з вдвічі меншим об'ємом потоку, ніж у першому. Якщо результати
обох пробігів співпадають, тестування задовільне; якщо
спостерігається очевидно вища розчинність при нижчому об'ємі
потоку, у цьому випадку зменшення об'єму потоку вдвічі має
продовжуватися до того часу, коли два пробіги підряд покажуть
однакову розчинність.
В обох випадках (з використанням рециркуляційного насосу або
рівноважного посуду) частки мають бути перевірені на наявність
колоїдних речовин шляхом дослідження їх на ефект Тиндалла
(розсіювання світла). Присутність таких часток робить результати
недійсними і тестування має проводитися повторно з більш високим
рівнем фільтрування речовин колони.
Має фіксуватися водневий показник кожного зразка. Другий
замір має проводитися при такій самій температурі.
1.6.4. Метод колби
1.6.4.1. Прилад
Для тестування за методом колби необхідні наступні матеріали:
- стандартний лабораторний набір скляного посуду та
інструментів,
- пристрій для перемішування розчинів при контрольованих
сталих температурах,
- центрифуга (бажано з термостатом), якщо в ній є потреба для
емульсій, та
- обладнання для визначення аналітичним шляхом.
1.6.4.2. Порядок проведення вимірів
Кількість матеріалу, необхідна для насичення бажаного об'єму
води розраховується з попереднього тестування. Об'єм води, що
вимагається, буде залежати від аналітичного методу та діапазону
розчинності. Близько п'яти разів кількість матеріалу, як визначено
вище, зважується в кожному з трьох видів скляного посуду зі
скляними пробками (наприклад, пробірки центрифуг, колби). Обраний
об'єм води додається до кожного з видів посуду і посуд щільно
закривається пробками. Закритий посуд струшується при 30 град.С.
(Має застосовуватися прилад для струшування або змішування,
здатний працювати при постійній температурі, наприклад, магнітне
змішування в регульованому водяному термостаті). Через день одна з
посудин видаляється та залишається для відновлення рівноваги на
24 години при температурі тестування, при цьому час від часу
струшуючись. Потім вміст посудини центрифугується при температурі
тестування і шляхом відповідного аналітичного методу визначається
концентрація тестової речовини у чистій водній фазі. З іншими
двома колбами проводяться такі самі заходи після первинного
врівноваження при 30 град.С протягом двох та трьох днів
відповідно. Якщо показники концентрації принаймні з двох останніх
посудин співпадають з відтворюваністю, що вимагається, в такому
випадку тестування задовільне. Тестування має проводитися заново з
наданням більш тривалого часу на врівноваження, якщо показники з
посудин 1, 2 та 3 мають тенденцію до зростання.
Порядок проведення вимірів може також виконуватися без
попередньої інкубації при 30 град.С. З метою оцінки показника
досягнення рівноважного насичення зразки проходять тестування до
того часу, доки час змішування перестане впливати на концентрацію
тестової речовини.
Має фіксуватися водневий показник кожного зразка.
1.6.5. Аналіз
Для таких вимірів бажано застосовувати метод аналізу
особливостей речовини, оскільки навіть малі частки розчинних
домішок можуть спричинити серйозні відхилення у показниках
розчинності. Прикладами таких методів є: газова або рідинна
хроматографія, методи титрування, фотометричні методи,
вольтамперометричні методи.
2. ДАНІ
2.1. МЕТОД ЕЛЮЮВАННЯ: ВИДАЛЕННЯ РЕЧОВИН З ХРОМАТОГРАФІЧНОЇ
КОЛОНИ
Відповідно до допустимого відхилення по стандарту, для
кожного циклу вираховується середній показник, щонайменше, з п'яти
послідовних вибірок. Результати подаються в одиницях маси на об'єм
розчину.
Показники отримані в результаті розрахунків з двох тестів, де
використовувались різні потоки рідин, відповідно порівнюються так,
щоб їх повторюваність була меншою 30%.
2.2. МЕТОД РОЗДІЛЕННЯ РІДИН ЗА ДОПОМОГОЮ КОЛБИ
Отримані необхідні результати по кожній з трьох колб слід
вважати незмінними (повторюваність менше 15%) та усередненими.
Одиниця вимірювання - маса на об'єм розчину. При потребі необхідно
перевести одиниці маси в одиниці об'єму, використовуючи таку
густину, коли розчинність дуже висока (> 100 грам/літр).
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
3.1. МЕТОД ЕЛЮЮВАННЯ: ВИДАЛЕННЯ РЕЧОВИН З ХРОМАТОГРАФІЧНОЇ
КОЛОНИ
Повідомлення результатів, якщо це можливо, має містити
наступну інформацію:
- результати попереднього тесту,
- точна специфікація речовини (характерні особливості та
домішки),
- індивідуальні концентрації, швидкість потоку/витрати рідини
та рівень рН кожної вибірки,
- величини та допустимі відхилення по стандарту, щонайменше,
п'яти вибірок стадії насиченості/поглинання з кожного циклу,
- середнє число двох наступних допустимих циклів,
- температура води під час процесу насиченості/поглинання,
- назва застосовуваного методу,
- структура застосовуваного допоміжного матеріалу,
- використання допоміжного матеріалу,
- застосовуваний розчинник,
- дані про хімічну нестабільність речовини протягом
тестування та метод застосування,
- будь-яка інформація стосовно інтерпретації результатів,
особливо щодо домішок та фізичного стану речовини.
3.2. МЕТОД РОЗДІЛЕННЯ РІДИН ЗА ДОПОМОГОЮ КОЛБИ
Повідомлення результатів, якщо це можливо, має містити
наступну інформацію:
- результати попереднього тесту,
- точна специфікація речовини (характерні особливості та
домішки),
- індивідуальні аналітичні підрахунки та середнє число (коли
для кожної колби визначалось більше одної величини),
- рН кожної вибірки,
- середнє число величини по різних сумісних колбах,
- температура під час тестування,
- застосовуваний аналітичний метод,
- дані про хімічну нестабільність речовини протягом
тестування та метод застосування,
- будь-яка інформація стосовно інтерпретації результатів,
особливо щодо домішок та фізичного стану речовини.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the
Council C(81) 30 final.
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 85) Chemical products for
industrial use - Determination of water solubility of solids and
liquids with low solubility - Column elution method.
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 85) Chemical products for
industrial use - Determination of water solubility of solids and
liquids with high solubility - Flask method.

Додаток

Малюнок 1
Метод елюювання: видалення речовин
з хроматографічної колони з використанням
рециркуляційного насосу
( 994_b14 )

Малюнок 2
Типова мікроколона
( 994_b14 )

Малюнок 3
Типова мікроколона
( 994_b14 )

Малюнок 4
Метод елюювання з використанням
вирівнювальних посудин
( 994_b14 )

А.8. КОЕФІЦІЄНТ РОЗПОДІЛУ
1. МЕТОД
Описаний метод із використанням "струшування колби"
проводиться із врахуванням Тестових Рекомендацій (1).
1.1. ВСТУП
Для проведення цього тесту необхідно мати попередню
інформацію про структурну формулу, константу дисоціації, показник
розчинності у воді, гідроліз, н-октанолову розчинність та
поверхневий натяг субстанції.
Замірювання необхідно проводити лише на прикладі іонізованих
речовин в їхній неіонізованій формі (вільна кислота або чиста
основа), виготовлених зі спеціальної буферної суміші, яка має не
менше однієї одиниці рН нижче (для вільної кислоти) або вище (для
чистої основи) пек.
Цей метод тестування включає дві окремих процедури: метод
струшування колби та хроматографію рідин високого тиску (ХРВТ).
Перший метод застосовується при логарифмічному показнику P
ow
(визначення дивіться нижче) в межах від 2 до 4, і другий метод при
показниках 0-6. До проведення одного з методів тестування,
необхідно попередньо вирахувати коефіцієнт розподілу.
Метод струшування колби застосовується лише до речовин
високої очистки, що розчиняються у воді та н-октанолі. Не можна
застосовувати цей метод до поверхнево-активних матеріалів (для
яких необхідні певні розрахунки щодо індивідуальних показників
розчинності у воді та н-октанолі).
Метод ХРВТ не застосовується до кислот із високою
концентрацією та основ, змішаних металів, поверхнево-активних
матеріалів чи речовин, які реагують на елюенти. Для таких
матеріалів необхідні певні розрахунки щодо індивідуальних
показників розчинності у воді та н-октанолі.
Під час застосування методу тестування ХРВТ наявність домішок
у суміші менш помітна, ніж у методі струшування колби. Проте, в
деяких випадках через такі домішки може бути важко отримати
правильні результати, оскільки максимальне розподілення є
нечітким. Для сумішей з нечітким діапазоном встановлюють верхнє та
нижнє обмеження показника Р.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
Коефіцієнт розподілу визначається, як співвідношення
рівноважних концентрацій (с ) розчиненої речовини в двофазній
i системі, що складається з двох розчинників, що не здатні
змішуватися між собою в достатній мірі. У випадку з н-октанолом та
водою коефіцієнт розподілу визначається так:
C
n-октанол
P = ---------- ow C
води
Таким чином, коефіцієнт розподілу (Р) є співвідношенням двох
концентрацій та подається, як правило, у формі співвідношення
логарифму до основи 10 (логарифм Р).
1.3. ЕТАЛОННА СУБСТАНЦІЯ
Метод струшування колби
Під час дослідження нової речовини непотрібно у всіх випадках
використовувати еталонні субстанції. Вони час від часу служать для
перевірки робочих характеристик методу та порівняння з
результатами інших методів.
Метод ХРВТ
Для того, щоб порівняти отримані розрахункові дані ХРВТ
суміші з її коефіцієнтом Р, необхідно встановити калібрувальну
криву логарифму Р стосовно/відносно хроматографічних даних, із
використанням не менше шести контрольних точок. Це необхідно для
того, щоб користувач міг обрати відповідні еталонні субстанції.
Якщо можливо, то необхідно, щоб хоча б одна із базових сумішей
мала показник Р вище за показник тестованої речовини, а інший
ow показник Р нижче показника тестованої речовини. Для
ow логарифмічних показників Р, які є менше 4, калібрування базується
на перевірених фактичних показниках, якщо такі не суперечать
розрахунковим даним. Для отримання точніших результатів, необхідно
підбирати такі базові суміші, що за своєю структурою відповідають
тестованій речовині.
Детальний/докладний перелік величин логарифму Р для
ow багатьох груп хімічних речовин представлено в (2)(3). Якщо дані
щодо коефіцієнтів розподілу для структурно відповідних сумішей
відсутні, тоді застосовують більш узагальнене калібрування на
прикладі інших сумішей.
Список рекомендованих еталонних речовин та їх величин Р
ow
представлено у Додатку 2.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
1.4.1. Метод струшування колби
Для визначення коефіцієнту розподілу необхідно, щоб була
досягнута рівновага між всіма взаємодіючими компонентами системи.
Вивчення спеціалізованої літератури з даного питання показує, що
можна використовувати кілька різних методів для вирішення цієї
проблеми. Наприклад, застосовується метод ретельного змішування
двох фаз з наступним їх розділенням, щоб визначити концентрацію
рівноваги для тестованої речовини.
1.4.2. Метод ХРВТ
Метод ХРВТ здійснюється на прикладі аналітичних колонок,
запакованих доступною в продажі твердою фазою, що має довгий
вуглеводний ланцюг (наприклад, С , С ), хімічно зв'язаний в
8 18 двоокис кремнію. Хімічні речовини, введені в таку колонку,
рухаються по ній із різною швидкістю, оскільки градус розподілу
рухомої фази відрізняється від вуглеводної нерухомої фази. Суміші
хімічних речовин елююються в порядку їх гідрофобності так, щоб
водорозчинні хімічні речовини елюювались першими, а маслорозчинні
останніми, у відповідності до коефіцієнту їх водо-вуглеводного
розподілу. Це дає можливість встановити відповідне співвідношення
між часом утримання хроматографічної речовини такої колонки
(зворотна фаза) та коефіцієнтом розподілу н-октанолу/води.
Коефіцієнт розподілу виводиться з коефіцієнту навантаження, k,
який вираховується так:
t - t
r o
k = -------- t
o
де, t = час утримання хроматографічної речовини сорбентом, а
r t = середній час, потрібний молекулі, щоб пройти крізь колонку
o (час простою).
Кількісно-аналітичні методи не є обов'язковими, а лише
потрібно визначити часи елюювання.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
1.5.1. Повторюваність
Метод струшування колби
На підтвердження точності коефіцієнту розподілу потрібно
провести подвійне визначення за трьох різних умов тестування,
відповідно до яких може змінюватись кількість визначеної речовини
та показник об'єму розчинення. Визначені величини вираженого
коефіцієнту розподілу при десятинному логарифмі мають знаходитись
в межах +- 0.3 логарифмічних одиниць.
Метод ХРВТ
Для більшої впевненості в розрахунках потрібно провести
подвійні визначення. Величини логарифму Р, виведені з
індивідуальних розрахунків, повинні бути в межах +- 0.1
логарифмічних одиниць.
1.5.2. Чуттєвість
Метод струшування колби
Діапазон вимірювань методу визначається за допомогою межі
виявлення аналітичної процедури. Це дає можливість провести
оцінювання величин логарифму Р в межах від 2 до 4 (інколи, якщо
ow цього дозволяють умови, можна розширити межі Р до 5), коли
ow концентрація розчиненої речовини у будь-якій фазі не перевищує
0.01 моль/літр.
Метод ХРВТ
Метод ХРВТ дає можливість визначити коефіцієнти розподілу
логарифму Р в межах від 0 до 6.
ow
Як правило, коефіцієнт розподілу суміші можна визначити до
+- 1 логарифмічної одиниці показника струшування. Типові
співвідношення можна знайти у літературі (4)(5)(6)(7)(8). Більшої
точності можна досягти тоді, коли криві співвідношень базуються на
структурному співвідношенні еталонних сумішей (9).
1.5.3. Специфіка
Метод струшування колби
Закон Нернста (Метод розподілу розчинної речовини) стосується
лише розчинів, що розбавляються при сталій температурі, мають
сталий тиск та рН. В обов'язковому порядку цей метод застосовують
до чистої речовини, розсіяної між двома чистими розчинниками. Якщо
в одній чи двох фазах одночасно є кілька різних розчинників, це
може впливати на результати.
Дисоціація чи асоціація розчинених молекул призводить до
відхилень від Закону Нернста. На факт таких відхилень вказує те,
що коефіцієнт розподілу залежить від концентрації розчину.
Без корекції даний метод тестування не слід застосовувати до
іонізованих сумішей через складну рівновагу. Щодо таких сумішей
слід розглянути можливість використання буферних розчинів замість
води; рН буферного розчину повинен становити 1 від рКа речовини,
беручи до уваги відповідність цього рН до навколишнього
середовища.
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Попередня оцінка коефіцієнту розподілу
Бажано, щоб коефіцієнт розподілу визначався методом
калькуляції (див. Додаток 1) або, якщо можливо, з показника
розчинності тестованої речовини в чистих розчинниках (10).
1.6.2. Метод струшування колби
1.6.2.1. Підготовка
Н-Октанол: визначення коефіцієнту розподілу проводиться за
допомогою хімічної речовини високої очистки.
Вода: необхідно використовувати дистильовану або двічі
дистильовану воду в скляній, або кварцовій посудині. За
необхідності, для іонізованих сумішей використовують буферні
розчини замість води.
Примітка:
Не дозволяється використовувати воду з іонообмінного фільтру.
1.6.2.1.1. Стадія перед поглинанням/змішуванням розчинників
До моменту визначення коефіцієнту розподілу обидві фази
системи розчинення слід піддати поглинанню/змішуванню методом
струшування при температурі експерименту. Для цього в механічному
шейкері протягом 24 годин струшують дві великих вихідних колби, що
містять аналітичний н-октанол високої очистки або воду, кожна з
них повинна мати достатню кількість іншого розчинника. Потім колби
зупиняють і дають постояти протягом тривалого часу, щоб фази
розділились до стану змішування/поглинання.
1.6.2.1.2. Підготовка до тесту
Тестова посудина заповнюється майже повністю цілим об'ємом
двофазної системи. Це дає можливість запобігти втраті матеріалу
через випаровування. Показник об'єму та кількості застосовуваної
речовини фіксується таким чином:
- попередня оцінка коефіцієнту розподілу (як вказано вище),
- мінімальна кількість тестованої речовини, необхідної для
аналітичного методу,
- обмеження максимальної концентрації в будь-якій фазі до
0.01 моль/літр.
Проводиться три тести. У першому тесті використовують
розрахований коефіцієнт об'єму н-октанолу у воді; у другому цей
коефіцієнт ділиться надвоє; та у третьому помножується на два
(наприклад, 1:1, 1:2, 2:1).
1.6.2.1.3. Речовина для тестування
Основний розчин готують в н-октанолі, змішаному з водою.
Концентрація такого основного розчину повинна бути точно визначена
перед тим, як визначатимуть коефіцієнт розподілу. Розчин
зберігають в умовах стійкості та стабільності.
1.6.2.1.3.1. Умови тестування
Температура під час проведення тесту повинна бути сталою
(+- 1 град.С) - в межах 20-25 град.С.
1.6.2.3. Процедура вимірювання
1.6.2.3.1. Встановлення балансу розподілу
Для кожної з умов тестування необхідно приготувати дублікати
тестових посудин, що містять необхідні, точно визначені об'єми
двох розчинників разом із необхідною кількістю основної речовини.
Фази н-октанолу вимірюють відповідно до об'єму. Посудини для
тесту поміщають у відповідний шейкер або струшують вручну. При
використанні центрифугальної пробірки рекомендується обертати
трубку швидко - 180 град. навколо своєї поперечної осі таким
чином, щоб будь-яке затримане повітря піднімалось через дві фази.
Досвід показує, що 50 таких обертів є достатнім для встановлення
балансу розподілу. Для більшої впевненості рекомендується
100 обертів протягом 5 хвилин.
1.6.2.3.2. Розділення фаз
Якщо необхідно, для розділення фаз суміш центрифугують. Це
роблять в лабораторній центрифузі при кімнатній температурі або,
якщо використовують центрифугу з не кімнатною температурою,
використовують центрифугальні пробірки, які для врівноваження
тримають при температурі тестування протягом години до проведення
аналізу.
1.6.2.4. Аналіз
Для визначення коефіцієнту розподілу необхідно визначити
ступінь концентрації тестової речовини в обох фазах. Для цього
беруть кратне кожної з фаз із кожної пробірки для кожної з умов
тестування, а потім їх аналізують за допомогою одного з методів.
Необхідно вирахувати та порівняти загальну кількість присутньої в
обох фазах речовини з тією кількістю, яка задавалась на початковій
стадії.
Вибірку водної фази проводять так, щоб мінімізувати ризик
виявлення слідів н-октанолу: зробити вибірку води можна за
допомогою скляного шприца зі змінною голкою. Перед цим шприц
повинен бути частково заповнений повітрям, яке акуратно
випускають, коли вводять голку у шар н-октанолу. Далі, певний
об'єм водної фази набирають у шприц. Потім шприц швидко усувають з
розчину, а голку знімають. Вміст шприца можна в подальшому
використовувати в якості водної вибірки. Бажано, щоб концентрація
двох розділених фаз визначалась методом специфікації речовини.
Прикладами відповідних аналітичних методів можуть бути наступні:
- фонометричні методи,
- газова хроматографія,
- хроматографія високоякісної хімічної рідини.
1.6.3. Метод ХРВТ
1.6.3.1. Підготовка
Прилад
Необхідно мати рідинний хроматограф з прилаштованим до нього
безімпульсним насосом та детектором. Рекомендується
використовувати клапан для вприскування та трубки/кільця.
Наявність полярних груп в стаціонарній фазі може досить послабити
робочі характеристики колонки ХРВТ. Тому необхідно, щоб
стаціонарні фази мали мінімальний відсоток полярних груп (11).
Можна використовувати готові запаковані колонки або доступні для
продажу пакування мікрочастинок зворотного чергування фаз. Захисна
колонка може бути розміщена між системою вприскування та
аналітичною колонкою.
Фаза руху
Високоякісні метанол та вода ХРВТ використовуються для
приготування елюенту (розчиннику для вимивання), який перед
використанням дегазують. Застосовується також ізократичне
елюювання. Використовується пропорційне співвідношення
метанол/вода, де вміст води становить 25%. Як правило, суміш
води/метанолу в пропорції 3:1, або навпаки, є достатньою для
елюювання сумішей з логарифмічним показником Р6 протягом години
при швидкості потоку 1 мл/хвилину. Для сумішей з високим
логарифмічним показником Р необхідно скоротити час елюювання (так
само як і для базових сумішей) шляхом зменшення полярності фази
руху чи довжини колонки.
Речовини з дуже низьким рівнем розчинності в н-октанолі мають
тенденцію показувати надто низькі логарифмічні показники Р при
ow застосуванні методу ХРВТ; іноді максимальні значення сумішей
супроводжують фронт розчинника. Це відбувається через те, що
процес розподілу є надто повільним, щоб досягнути
рівноваги/балансу протягом часу, який витрачається на розділення
ХРВТ. Тому, для того, щоб отримати достовірні значення, необхідно
зменшити швидкість потоку та/чи знизити коефіцієнт метанолу/води.
Під час фази руху базові суміші та суміші для тестування
повинні розчинятись у концентраціях, достатніх для їх виявлення.
Лише в окремих випадках дозволяється використовувати домішки із
сумішшю води - метанолу, оскільки домішки мають здатність
змінювати властивості колонки. Для хроматограм із домішками
обов'язково використовувати окрему колонку того самого типу. У
випадку, якщо не підходить суміш води - метанолу, можна
використовувати інші органічні суміші, що розчиняються у воді
(наприклад, етанол-вода чи ацетонітрил-вода).
Для іонізованих сумішей рН елюенту є критичним. Він має бути
в межах робочого діапазону колонки, як правило, від 2 до 8.
Рекомендується буферизація. Необхідно бути обережним, щоб не
допустити осідання солі та пошкодження колонки, що трапляються у
випадку з деякими органічними фазовими/буферними сумішами. Не
рекомендується допускати розмірів ХРВТ, основаних на стаціонарній
фазі з використанням двоокису вуглецю, що перевищують 8 рН,
оскільки використання лужної, рухомої фази може спричинити швидке
погіршення робочих характеристик колонки.
Розчини
Необхідні базові суміші найвищої очистки без домішок. Суміші,
які використовуватимуть для тестування чи калібрування,
розчиняють, якщо можливо, в рухомій фазі.
Умови тестування
Температура під час вимірювання не повинна змінюватись більше
+- 2 K.
1.6.3.2. Вимірювання
Обчислення t - середнього часу, потрібного молекулі, щоб
0 пройти крізь колонку (час простою)
Середній час t визначається за допомогою гомологічного ряду
0 (наприклад, налкилометилокетонів) або нестриманих органічних
сумішей (наприклад, тиосечовини чи формаміду). Для обчислення t
0
за допомогою гомологічного ряду необхідно ввести, щонайменше, сім
елементів гомологічного ряду та визначити час утримання
хроматографічної речовини сорбентом. Невідкорегований час
утримання хроматографічної речовини сорбентом t (n + 1)
r c
наноситься на графік, як функція t (n ), і визначаються відрізок а
r c та дуга b рівняння регресії:
t = a + b t
r(nc+ 1) r(nc)
де n = кількість атомів вуглецю. Час простою тоді
c визначається так: t = a/(1 - b)
0
Графік калібрування
Наступним кроком буде створення кореляційного графіку
показника логарифму k у відношенні до логарифму р відповідних
базових сумішей. На практиці відбувається наступне: набір
5-10 базових сумішей із логарифмічним показником р в межах
очікуваних розрахунків вводиться одночасно, і визначається час
утримання за допомогою записуючого інтегратора, з'єднаного з
системою визначення. Відповідні логарифми коефіцієнтів
завантаження, логарифму k, обчислюються та наносяться на графік,
як функція логарифму р, що визначається методом струшування.
Калібрування проводиться регулярними інтервалами, щонайменше, один
раз на день і таким чином, щоб допускались можливі зміни в робочих
характеристиках колонки.
Визначення коефіцієнту завантаження тестованої речовини
Тестована речовина вводиться в якомога меншій кількості
рухомої фази. Визначається час утримання (в дублікаті), з
можливістю обчислення коефіцієнту завантаження k. З кореляційного
графіку базових сумішей, інтерполюється коефіцієнт розподілу
тестованої речовини. Для дуже високих та дуже низьких коефіцієнтів
розподілу необхідна екстраполяція. В подібних випадках для лінії
регресії необхідно встановити рівні певності.
2. ДАНІ
Метод струшування колби
Достовірність визначених показників Р можна перевірити,
шляхом порівняння дубльованих визначень із загальним значенням.
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Повідомлення результатів, якщо це можливо, повинно містити
наступну інформацію:
- точна специфікація речовини (характерні особливості та
домішки),
- коли не застосовують методи (наприклад, поверхнево-активний
матеріал) потрібен обчислений показник або визначення розчинності
у воді та н-октанолі,
- будь-яка інформація стосовно інтерпретації результатів,
особливо щодо домішок та фізичного стану речовини.
Для методу струшування колби:
- результати попередньої оцінки, якщо такі є,
- температура при визначенні,
- дата аналітичних методів, застосовуваних при визначенні
концентрацій,
- час та швидкість конфігурації, якщо такі застосовуються,
- виміряні концентрації в обох фазах для кожного визначення
(це означає, що повідомлятимуться результати 12 концентрацій),
- вага тестованої речовини, об'єм кожної фази, використаної в
кожній посудині для тестувань та загальна вирахувана кількість
тестованої речовини, що залишається в кожній фазі після
врівноваження/балансування,
- обчислені показники коефіцієнту розподілу (Р) та середній
показник повідомляються по кожній серії умов тестування так само,
як і середній показник всіх визначень. Якщо щось вказує на
залежність від концентрації коефіцієнту розподілу, тоді це також
повідомляється у звітуванні,
- середнє квадратичне відхилення величин Р.
- середнє значення Р всіх визначень також повинно виражатись
як логарифм (база 10),
- обчислений теоретичний показник Р , якщо визначалась його
ow
4 величина чи якщо виміряна величина є > 10 ,
- рН використаної води та водної фази під час експерименту,
- якщо використовують буферні розчини, надати інформацію про
доцільність їх використання замість води; склад та рН буферних
розчинів, рН водної фази до і після експерименту.
Для методу ХРВТ:
- результати попередньої оцінки, якщо такі є,
- базові речовини та речовини для тестування (без домішок),
- температурний режим визначень,
- рН при якому проводились визначення,
- деталі аналітичної та захисної колонки, фази руху та засоби
виявлення,
- дані про утримання та фактичні показники логарифму Р
базових сумішей, застосованих в калібруванні,
- деталі підібраної лінії регресії (відношення логарифму k до
логарифму P),
- дані середнього утримання та інтерпольованої величини
логарифмічного показника Р для тестованої суміші,
- опис обладнання та робочих умов,
- профілі елюювання,
- кількість тестованих та базових речовин, представлених в
колонці,
- час простою та його визначення.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the
Council C(81) 30 final.
(2) C.Hansch and A.J.Leo, Substituent Constants for
Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New
York, 1979.
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative
prediction of bioactivity (C.Hansch, chairman, A.J.Leo, dir.) -
Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982,
Pomona College, Claremont, California 91711.
(4) L.Renberg, G.Sundstrom and K.Sundh-Nygard, Chemosphere,
1980, vol. 80, p. 683.
(5) H.Ellgehausen, C.D'Hondt and R.Fuerer, Pestic. Sci.,
1981, vol. 12, p. 219.
(6) B.McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73.
(7) W.E.Hammers et al., J.Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.
(8) J.E.Haky and A.M.Young, J.Liq. Chromat., 1984, vol. 7,
p. 675.
(9) S.Fujisawa and E.Masuhara, J.Biomed. Mat. Res., 1981,
vol. 15, p. 787.
(10) O.Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis
(edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band
I/1, p. 223-339.
(11) R.F.Rekker and H.M.de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979,
vol. 14, p. 479.
(12) A.Leo, C.Hansch and D.Elkins, Partition coefficients and
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
(13) R.F.Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant,
Elsevier, Amsterdam, 1977.
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for
industrial use - Determination of partition coefficient - Flask
shaking method.
(15) C.V.Eadsforth and P.Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,
p. 1459.
(16) A.Leo, C.Hansch and D.Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71,
p. 525.
(17) C.Hansch, A.Leo, S.H.Unger, K.H.Kim, D.Nikaitani and
E.J.Lien, J.Med.Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.
(18) W.B.Neely, D.R.Branson and G.E.Blau, Environ. Sci.
Technol., 1974, vol. 8, p. 1113.
(19) D.S.Brown and E.W.Flagg, J.Environ. Qual., 1981,
vol. 10, p. 382.
(20) J.K.Seydel and K.J.Schaper, Chemische Struktur und
biologische Aktivitat von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim,
New York, 1979.
(21) R.Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier,
Amsterdam, 1984.
(22) Y.C.Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker,
New York, Base1, 1978.
(23) N.S.Nirrlees, S.J.Noulton, C.T.Murphy, P.J.Taylor;
J.Med.Chem., 1976, vol. 19, p. 615.

Додаток 1

Методи підрахунків та оцінки

ВСТУП
Загальні положення щодо методів підрахунку, даних та
прикладів містяться в Довіднику Методів Оцінки Хімічних
Властивостей (а).
Обчислені показники Р можна використати:
ow
- для вирішення, який з експериментальних методів є
відповідним (межі струшування колби: логарифм Р : від -2 до 4),
ow межі ХРВТ: логарифм Р : від 0 до 6),
ow
- для вибору відповідних умов тестування (наприклад, базові
речовини для методів ХРВТ, об'єм н-октанолу/води для методу
струшування колби),
- в якості лабораторної внутрішньої перевірки з метою
виявлення можливих експериментальних помилок,
- для забезпечення оцінки Р у випадках, коли
ow експериментальні методи не застосовуються через технічні причини.
МЕТОД ОЦІНКИ
Попередня оцінка коефіцієнту розподілу
Величина коефіцієнту розподілу визначається шляхом розчинення
тестованої речовини в чистих розчинниках:
Для цього застосовують формулу:
змішування C
n-октанол
Р = ---------------------- визначення змішування C
води
МЕТОДИ РОЗРАХУНКУ
Основний принцип методів розрахунку
Всі методи розрахунку побудовані на формальній фрагментації
молекули на відповідні підструктури, для яких відомі збільшення
логарифму Р . Логарифм Р цілої молекули далі обчислюється, як
ow ow сума її фрагментальних величин плюс сума поправкових членів для
внутрішньомолекулярної взаємодії.
Список фрагментарних констант та поправкових членів подано у
пунктах (b)(c)(d)(e); деякі з них постійно оновлюються (b).
Критерій якості
Загалом, надійність методу розрахунків зменшується по мірі
того, як збільшується складність самої тестованої суміші. У
випадку, коли йдеться про молекули з низькою молекулярною вагою та
одну-дві функціональні групи, допускається похибка в 0,1-0,3
одиниці логарифму Р між результатами різних фрагментарних
ow методів та виміряним показником. Якщо беруться складніші молекули,
тоді межа похибки може збільшуватись. Це залежатиме від надійності
та доступності фрагментальних констант, а також від здатності
виявити інтрамолекулярні взаємодії (наприклад, вуглеводні зв'язки)
та правильне використання поправкових членів (менше проблем з
програмним забезпеченням CLOGP-3) (b). У випадку з іонізованими
сумішами важливо правильно підібрати заряд та ступінь іонізації.
Метод проведення розрахунків
пі-метод Ханша
Перша гідрофобна константа заміщення - пі, представлена
Фуджірою та іншими (f) визначається так:
пі x = log P (PhX) - log P (PhH)
ow ow
де P (PhX) - коефіцієнт розподілу ароматичної похідної і
ow P (PhH) - коефіцієнт розподілу заміщу вальної суміші, наприклад:
ow
(пі = log P (C H Cl) - log P (C H ) = 2,84 - 2,13 = 0,71).
Cl ow 6 5 ow 6 6
Згідно визначення, пі-метод застосовується, головним чином,
до ароматичних заміщень. Величини пі для великої кількості
заміщувачів, подані у таблицях (b)(c)(d). Вони використовуються
для обчислення логарифму P ароматичних молекул чи підструктур.
ow
Метод Рекера
Згідно цього методу (g), показник логарифма P обчислюється
ow так:
log P = S a f + S (періоди взаємодії)
ow i i i j
S - знак суми
де f представляє різні константи молекулярних фрагментів та
i a - частоту їх випадків в досліджуваній молекулі. Поправкові
i члени можуть виражатися як інтегральна множинність однієї єдиної
константи C (так званої магічної константи). Фрагментарні
m константи f and C були визначені з переліку 1 054
i m експериментальних значень P (825 складових), використовуючи
ow складовий регресивний аналіз (c)(h). Визначення умов взаємодії
здійснюється відповідно до низки правил, описаних в літературі
(e)(h)(i).
Метод Хенша-Лео
log P = S a f + S b F
ow i i i j j j
S - знак суми
Де f представляє різні константи молекулярних фрагментів,
i F - поправкові члени, та a , b - відповідні частоти випадків.
j i j Виведений з експериментальних величин P , перелік елементарних і
ow групових фрагментарних величин та перелік поправкових членів F
j
(так званих факторів) визначались методом проб та помилок.
Поправкові члени впорядковуються в декілька різних класів (а)(с).
Для того, щоб врахувати всі правила та поправкові члени, потрібно
витратити багато часу, оскільки це досить важко. Також розроблено
відповідне програмне забезпечення (b).
Комбінований метод
Обчислення логарифмічного показника P складних молекул
ow можна значно покращити, якщо молекула розкладається на більші
підструктури, для яких існують чіткі показники P , з таблиць
ow (b)(c) або з власних розмірів. Такі фрагменти (наприклад, гетеро
цикли, антраквінони, азобензоли) можна потім комбінувати
з пі величинами Ханша або Рекера, або з констант фрагментарними
константами Лео.
Примітки
(i) методи ведення розрахунків можна застосовувати до
повністю або частково іонізованих сумішей тоді, коли можливо
врахувати всі необхідні поплавкові коефіцієнти;
(ii) якщо допускаються інтрамолекулярні водневі зв'язки, тоді
необхідно додати поправкові члени (приблизно, від + 0,6 до + 1,0
логарифма P ) (а). виявити наявність таких зв'язків можна зі
ow
стерео моделей або спектроскопічних даних молекули;
(iii) якщо можливо використати таутомерні форми, тоді за
основу розрахунку беруть найбільш вірогідні таутомерні форми.
(iv) уважно перевірити списки фрагментарних констант.
Повідомлення результатів
- опис субстанції (суміш, домішки і т.д.),
- вказати на можливі інтрамолекулярні водневі зв'язки,
дисоціації, заряд та інші незвичні впливи (наприклад, таутомерія),
- опис методу розрахунків,
- ідентифікація або надання бази даних,
- особливості вибору фрагментів,
- повна документація розрахунків,
ЛІТЕРАТУРА
(a) W.J.Lyman, W.F.Reehl and D.H.Rosenblatt (ed.), Handbook
of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York,
1983.
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont,
California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software
(Program CLOGP-3).
(c) C.Hansch, A.J.Leo, Substituent Constants for Correlation
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
(d) A.Leo, C.Hansch, D.Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71,
p. 525.
(e) R.F.Rekker, H.M.de Kort, Eur.J.Med. Chem. -Chill. Ther.
1979, vol. 14, p. 479.
(f) T.Fujita, J.Iwasa and C.Hansch, J.Amer.Chem.Soc., 1964,
vol. 86, p. 5175.
(g) R.F.Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant,
Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.
(h) C.V.Eadsforth, P.Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,
p. 1459.
(i) R.A.Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington
D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Додаток 2

Рекомендовані базові суміші для Методу ХРВТ
__________________________________________________________________
N Базова суміш логарифм P рКа
ow __________________________________________________________________
1 2-бутанон 0.3
2 4-ацетилперідин 0.5
3 анілін 0.9
4 ацетанілід 1.0
5 бензоловий спирт 1.1
6 p-метоксифенол 1.3 рКа = 10.26
7 феноло-оцтова кислота 1.4 рКа = 3.12
8 фенол 1.5 рКа =9.92
9 2,4-динітрофенол 1.5 рКа =3.96
10 бензонітрил 1.6
11 фениоацетонітрил 1.6
12 4-метилобензиловий спирт 1.6
13 ацетофенон 1.7
14 2-нітрофенол 1.8 рКа = 7.17
15 3-нітробензойна кислота 1.8 рКа = 3.47
16 4-хлоранілін 1.8 рКа = 4.15
17 нітробензол 1.9
18 коричний спирт 1.9
19 бензойна кислота 1.9 рКа = 4.19
20 p-крезол 1.9 рКа = 10.17
21 корична кислота 2.1 рКа = 3.89 cis 4.44trans
22 анізол 2.1
23 метилбензоат 2.1
24 бензол 2.1
25 3-метилобензойна кислота 2.4 рКа = 4.27
26 4-хлорофенол 2.4 рКа = 9.1
27 трихлоретилен 2.4
28 атразін 2.6
29 етилбензоат 2.6
30 2,6-дихлорбензонітрил 2.6
31 3-хлоробензойна кислота 2.7 рКа = 3.82
32 толуол 2.7
33 1-нафтол 2.7 рКа = 9.34
34 2,3-дихлоранілін 2.8
35 хлорбензол 2.8
36 алил-фенилетил 2.9
37 бромобензол 3.0
38 етилбензол 3.2
39 бензофенон 3.2
40 4-фенилфенол 3.2 рКа = 9.54
41 тимол 3.3
42 1,4- дихлорбензол 3.4
43 дифеніламін 3.4 рКа = 0.79
44 нафталін 3.6
45 фенилбензоат 3.6
46 ізопропилбензол 3.7
47 2,4,6-трихлорфенол 3.7 рКа = 6
48 біфеніл 4.0
49 бензилбензоат 4.0
50 2,4-динітро -
6 сек. бутилфенол 4.1
51 1,2,4-трихлорбензол 4.2
52 додекаїнова кислота 4.2
53 дифенелен 4.5
54 н-бутилбензен 4.5
55 фенатрен 4.5
56 флуорантен 4.7
57 дибензил 4.8
58 2,6-дифенилпередін 4.9
59 трифениламін 5.7
60 інсектицид 6.2
Інші базові суміші з нижчим логарифмом Р
ow
1 нікотинова кислота - 0.07

А.9. ВИЗНАЧЕННЯ ТЕМПЕРАТУРИ СПАЛАХУ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Доцільно отримати попередню інформацію щодо займистості
речовини перед проведенням самого тесту. Процедура тестування
стосується рідин, чиї пари можуть спалахувати від джерел займання.
Наведені в даному тексті методи тестування достовірні лише для
визначення меж температури спалаху, які в кожному методі мають
індивідуальний характер.
Під час вибору методу тестування необхідно враховувати
ймовірність виникнення хімічних реакцій між рідиною та тримачем
зразка.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
Температура спалаху - це температура, відкоригована до тиску
в 101,325 кПа, при якій рідина випускає пари за умов, визначених
методом тестування, і в тій кількості, в якій легкозаймиста суміш
пари/повітря утворюється в посудині.
Одиниці виміру: град.С
t = T - 273,15
(t у град.C та T у K)
1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ
В процесі дослідження нової речовини непотрібно у всіх
випадках застосовувати базові речовини. Вони повинні
використовуватись для того, щоб можна було час від часу перевіряти
робочі характеристики методу та порівнювати з результатами інших
методів.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Речовина розміщується в посудину для тестування та
нагрівається чи охолоджується до температури, описаної в
індивідуальному методі тестування. Пробні спалахування проводять
для того, щоб вияснити чи спалахнув зразок при заданій тестовій
температурі.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
1.5.1. Повторюваність
Повторюваність змінюється відповідно до межі точки
спалахування в умовах застосованого методу тестування; максимум
2 град.С.
1.5.2. Чутливість
Чутливість залежатиме від виду тесту.
1.5.3. Специфіка
Специфіка деяких методів тестування обмежується певними
межами точок спалахування, а також залежить від інших даних, що
стосуються речовини (наприклад, висока в'язкість).
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Підготовка
Зразок тестованої речовини поміщають у прилад для проведення
тесту, відповідно до пунктів 1.6.3.1 та/чи 1.6.3.2.
З метою дотримання норм безпеки, рекомендується, щоб метод
тестування, в якому використовується розмір зразка 2 куб.см,
використовували для енергетичних або токсичних речовин.
1.6.2. Умови проведення тесту
Прилад, що застосовується для проведення тесту, повинен бути
безпечним та розміщуватись подалі від тяги повітря.
1.6.3. Виконання тесту
1.6.3.1. Метод рівноважності/визначення балансу
Див. МОС 1516, МОС 3680, 1523, МОС 3679.
1.6.3.2. Метод нерівноважності
Прилад Абеля:
Див. BS 2000 частина 170, NF M07-011, NF T66-009.
Прилад Абеля-Пенські:
Див. ЄН 57, НІС (Німецький Інститут Стандартів) 51755
частина 1 (для температур від 5 до 65 град.C), НІС 51755 частина 2
(для температур нижче 5 град.C), NF M07-036.
Прилад Таг:
Див. ААВМ D 56.
Прилад Пенські-Мартенса:
Див. МОС 2719, ЄН 11, НІС 51758, ААВМ D 93, BS 2000-34,
NF M07-019.
Примітки:
Якщо за допомогою методу нерівноважності (1.6.3.2) буде
виявлено, що температура спалаху становить 0 +- 2 град.С,
21 +- 2 град.С або 55 +- 2 град.C, тоді це необхідно підтвердити
методом рівноважності, використовуючи той самий прилад.
Повідомляти необхідно лише про ті методи, які дають змогу
визначити температуру спалаху.
Для того, щоб визначити температуру спалаху в'язких рідин
(фарби, смоли і т.д.), які містять розчинники, необхідно
застосовувати лише відповідні методи та прилади.
Див. МОС 3679, МОС 3680, МОС 1523, НІС 53213 частина 1.
2. ДАНІ
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Повідомлення результатів має включати таку інформацію:
- точна специфікація речовини (характерні особливості та
домішки),
- назва методу, що застосовувався, а також можливі
відхилення,
- результати та будь-які додаткові примітки, що стосуються
інтерпретації результатів.
4. ПОСИЛАННЯ
Немає.

А.10. ЗАЙМИСТІСТЬ (ТВЕРДІ РЕЧОВИНИ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Перед проведенням тесту бажано мати попередню інформацію щодо
можливих вибухових властивостей речовини.
Тест застосовується лише до порошкоподібних, гранульованих
або пастоподібних речовин.
Для того, щоб не включати всі спалахуючі речовини, окрім тих,
що швидко горять чи тих, чия горючість надто небезпечна,
сильноспалахуючими слід вважати лише ті речовини, швидкість
горіння яких перевищує певний обмежуючий показник.
Особливо небезпечно, якщо тепловий білий жар поширюватиметься
крізь білий порошок, оскільки погасити вогонь може бути досить
важко. Металеві порошки вважаються швидкозаймистими, якщо вони
допускають поширення теплового жару через суміш протягом певного
часу.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
Час горіння виражається в секундах.
1.3. БАЗОВІ СУМІШІ
Не визначено.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Речовина формується в герметично закритий рулон або вогняний
ланцюг довжиною 250 мм. Далі проводиться попередній скрінінг -
тест, щоб запалювання при запалюванні газовим полум'ям визначити
чи горіння поширюватиметься завдяки цьому полум'ю або через
тління. Якщо вогонь поширюється вогняним ланцюгом більше 200 мм
протягом визначеного часу, тоді проводять повне тестування з метою
визначення швидкості горіння.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Не вказано.
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Попередній скрінінг - тест
Речовина формується в герметично закритий рулон або вогняний
ланцюг довжиною 250 мм, 20 мм шириною та висотою 10 мм, ставиться
на опорну плиту, яка повинна бути вогнетривкою, непористою та мати
низьку теплопровідність. Високотемпературний факел від газової
горілки (мін. діаметр 5 мм) підводиться до одного кінця вогняного
ланцюга поки він не загориться або максимум на 2 хвилини
(5 хвилин - для металевих порошків або порошків з металу та інших
домішок). Необхідно звернути увагу на те, чи поширюватиметься
горіння на всі 200 мм ланцюга протягом 4 хвилин, чи 40 хвилин
(коли йдеться про металеві порошки). Якщо речовина не загорається
та не поширює горіння від полум'я чи тління на відрізку вогняного
ланцюга в 200 мм протягом 4 хвилин, чи 40 хвилин (коли йдеться про
металеві порошки) тестового періоду, тоді така речовина не
вважатиметься легкозаймистою, і подальше тестування непотрібно.
Якщо ж речовина поширює горіння на відрізку вогняного ланцюга в
200 мм за менш, ніж 4 хвилини, чи 40 хвилин (коли йдеться про
металеві порошки), необхідно застосувати нижчеописану процедуру
(див. пункт 1.6.2. та наступні).
1.6.2. Тест на визначення швидкості горіння
1.6.2.1. Підготовка
Порошкоподібні чи гранульовані речовини засипають негусто в
форму 250 мм довжини, що має трикутні поперечні розрізи по 10 мм
висотою та 20 мм шириною. По обидві сторони форми в повздовжньому
напрямку кріпляться дві металеві платформи, які слугують боковими
обмежувачами на відстані 2 мм від верхнього краю трикутного
поперечного перерізу. Далі, форму тричі кидають з висоти 2 см на
тверду поверхню. За необхідності форму наповнюють знову. Потім
бокові обмежувачі забирають, а решту речовини усувають. Платформа,
яка є вогнетривкою, непористою та має низьку теплопровідність,
ставиться зверху форми, потім прилад перевертають, а форму
забирають.
Пастоподібні речовини розмащують по платформі, яка є
вогнетривкою, непористою та має низьку теплопровідність, у форму
канату завдовжки 250 мм з поперечним перерізом в 1 кв.см.
1.6.2.2. Умови тестування
Якщо застосовуються чутливі до вологи речовини, тоді тест
необхідно провести якнайшвидше, і відразу після виймання речовини
з контейнера.
1.6.2.3. Виконання тесту
У витяжній шафі розмістіть купку з речовиною навпроти тяги.
Швидкість вітру має бути такою, щоб запобігти попаданню
вихлопів та випаровувань в лабораторію, а також швидкість не
повинна змінюватись в ході тестування. Довкола приладу
встановлюється витяжний екран.
Для запалювання стовпчика з речовиною застосовують
високотемпературний факел від газової горілки (мін. діаметр 5 мм).
Коли стовпчик прогоріла досягнув 80 мм, вимірюється швидкість
горіння наступних 100 мм.
Тест повторюють шість разів, використовуючи при цьому щоразу
чисту, охолоджену платформу, якщо раніше не було отримано
позитивного результату.
2. ДАНІ
Для проведення адекватної та достатньої оцінки необхідно
отримати час горіння з попереднього скрінінг - тесту (1.6.1.) та
час горіння, показаний в 6 тестах (1.6.2.3.).
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
3.1. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ
За можливості, результати мають включати:
- точну специфікацію речовини (характерні особливості та
домішки),
- опис тестованої речовини, фізичний стан, включаючи вміст
вологи,
- результати попереднього скрінінг - тесту і результати тесту
з визначення швидкості горіння, якщо такий тест проводився,
- всі додаткові примітки щодо інтерпретації результатів.
3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Порошкоподібні, гранульовані або пастоподібні речовини
вважаються сильнозаймистими тоді, коли час горіння в будь-яких
проведених тестах, відповідно до описаної у пункті 1.6.2 методики
проведення тестів, становить менше 45 секунд. Порошкоподібні
речовини чи речовини, що мають в своєму складі метал та інші
домішки, вважаються сильнозаймистими тоді, коли вони займаються і
полум'я або зона реакції поширюється на весь зразок речовини за 10
і менше хвилин.
4. ПОСИЛАННЯ
NF T 20-042 (September 85) Chemical products for industrial
use. Determination of the flammability of solids.

Додаток

Малюнок
Форма та засоби для приготування стовпчика
( 994_b14 )

А.11. ЗАЙМИСТІСТЬ (ГАЗИ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Даний метод дозволяє визначити, чи гази, змішані з повітрям
кімнатної температури (приблизно 20 град.С) і атмосферним тиском,
є займистими, і, якщо так, то в межах яких концентрацій. Суміші
збільшуваних концентрацій тестованого газу і повітря піддають
електричному розряду (іскрі), і спостерігають за тим, чи
відбувається запалювання.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
Межа займистості - це межа концентрації між нижчими та вищими
рівнями спалаху/вибуху. Нижчий та вищий рівні спалаху - це ті
рівні концентрації займистого газу, змішаного з повітрям, при яких
не відбувається поширення полум'я.
1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ
Не визначені.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Концентрація газу в повітрі збільшується поступово, і суміш
на кожній стадії піддають дії електричного розряду.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Не вказані.
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Прилад
Посудина для проведення тестування - це прямий скляний
циліндр з мінімальним внутрішнім діаметром 50 мм та мінімальною
висотою 300 мм. Електроди запалювання знаходяться на відстані
3-5 мм та розташовуються в 60 мм над поверхнею циліндра. Циліндр
має отвір для випускання тиску (декомпресійний отвір). Прилад має
бути захищений від ушкоджень на випадок вибуху.
В якості джерела запалювання використовується постійна іскра
тривалістю 0.5 секунд, яку генерує високовольтний трансформатор з
вихідною напругою 10-15 кіловольт (максимальна вхідна напруга
300 Вт). В посиланні (2) показано приклад такого відповідного
приладу.
1.6.2. Умови тестування
Тест необхідно проводити при кімнатній температурі (приблизно
20 град.С).
1.6.3. Проведення тесту
Використовуючи дозувальні насоси, в скляний циліндр вводиться
відома концентрація газу в повітрі. Далі, іскра проходить крізь
суміш, і спостерігаємо, чи полум'я відділяється від джерела
запалювання і поширюється самостійно. Концентрація газу поступово
змінюється (в районі 1% від об'єму) до тих пір, поки не
відбудеться запалювання, як описано вище.
У випадку, якщо хімічна структура газу вказує на те, що цей
газ є незаймистим, і склад стехіометричної суміші з повітрям можна
вирахувати, тоді необхідно тестувати лише такі суміші, які мають
на 10% більше стехіометричного складу і на 10% менше. Тестування
сумішей такого складу проводиться з урахуванням того, що
концентрація газу поступово змінюється (в районі 1% від об'єму).
2. ДАНІ
Єдиною інформацією щодо визначення таких властивостей є
інформація про частоту поширення полум'я.
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
За можливості результати тесту мають включати наступну
інформацію:
- точну специфікацію речовини (характерні особливості та
домішки),
- опис та розміри застосовуваного приладу,
- температуру, при якій проводився тест,
- перевірені концентрації та отримані результати,
- результати тесту: незаймистий газ або сильно займистий газ,
- у випадку, якщо газ незаймистий - інформація про межу
концентрації, згідно якої газ тестували, відповідно до того,
концентрація газу поступово змінюється (в районі 1% від об'єму),
- всі додаткові примітки щодо інтерпретації результатів.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) NF T 20-041 (September 85) Chemical products for
industrial use. Determination of the flammability of gases.
(2) W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H. Grosse-Wortmann
'Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von
Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- Tech. 1984, vo1. 56, 2, 126-127.,
T.Redeker und H.Schacke, p. 126-127.

A.12. ЗАЙМИСТІСТЬ (КОНТАКТ З ВОДОЮ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Даний вид тестування допоможе визначити, чи реакція речовини
з водою або вологим повітрям приводить до утворення небезпечної
кількості газу/газів, що можуть бути досить сильнозаймистими.
Такий метод тестування можна застосувати, як для рідин, так і
для твердих речовин. До речовин, які спалахують спонтанно від
контакту з повітрям, такий тест не застосовується.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
Сильнозаймисті речовини: речовини, котрі при контакті з водою
або вологим повітрям, виділяють сильно займисті гази в небезпечній
кількості при мінімальній швидкості 1 літр/кг у годину.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Речовина тестується в певній послідовності, поступово, як
описано нижче; якщо на якомусь етапі відбувається спалахування,
тоді подальше тестування непотрібно. Якщо ж стає відомо, що
речовина не бурно реагує на воду, тоді переходять до наступного
етапу 4 (1.3.4.).
1.3.1. Етап 1
Речовину поміщають в лоток з дистильованою водою при
t 20 град.С і спостерігають, чи виділений газ спалахне.
1.3.2. Етап 2
Речовину поміщають у фільтрувальний папір, що плаває на
поверхні посудини з дистильованою водою при t 20 град.С і
спостерігають, чи виділений газ спалахне. Фільтрувальний папір
використовують для того, щоб речовина перебувала в нерухомому
стані, і тим самим збільшувалась ймовірність запалювання.
1.3.3. Етап 3
Тестовану речовину кладуть у вигляді стовпчика заввишки 2 см
та діаметром 3 см. Додають кілька крапель води, і спостерігають,
чи виділений газ спалахне.
1.3.4. Етап 4
Речовину змішують з дистильованою водою при t 20 град.С, і
протягом семи годин (інтервал - 1 година) вимірюють виділення
газу. Якщо швидкість виділення газу непостійна або збільшується
після семи годин, тоді час вимірювання збільшують до п'яти днів
максимум. Тестування припиняють, якщо швидкість в будь-який момент
зростає, із розрахунку 1 літр/кг в годину.
1.4. БАЗОВІ СУМІШІ
Не визначені.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Не вказано.
1.6. ОПИС МЕТОДІВ
1.6.1. Етап 1
1.6.1.1. Умови тестування
Тестування проводиться при кімнатній температурі (приблизно
20 град.С).
1.6.1.2. Проведення тесту
Невелику кількість (приблизно 2 мм в діаметрі) тестованої
речовини кладуть в лоток з дистильованою водою. Необхідно
спостерігати, чи виділятиметься який-небудь газ (i), і чи
відбудеться запалювання цього газу (ii). Якщо газ спалахне, тоді
подальше тестування речовини непотрібне, оскільки така речовина
вважається небезпечною.
1.6.2. Етап 2
1.6.2.1. Прилад
Застосовують фільтрувальний папір, який має плавати рівно на
поверхні води в будь-якій посудині, наприклад, у чашці для
випаровування діаметром 100 мм.
1.6.2.2. Умови тестування
Тестування проводиться при кімнатній температурі (приблизно
20 град.С).
1.6.2.3. Проведення тесту
Невелику кількість (приблизно 2 мм в діаметрі) тестованої
речовини кладуть в центрі фільтрувального паперу. Необхідно
спостерігати, чи виділятиметься який-небудь газ (i), і чи
відбудеться запалювання цього газу (ii). Якщо газ спалахне, тоді
подальше тестування речовини непотрібне, оскільки така речовина
вважається небезпечною.
1.6.3. Етап 3
1.6.3.1. Умови тестування
Тестування проводиться при кімнатній температурі (приблизно
20 град.С).
1.6.3.2. Проведення тесту
Тестовану речовину формують у вигляді стовпчика заввишки,
приблизно, 2 см і 3 см діаметром, роблячи зверху виїмку. Потім у
виїмку додають кілька крапель води та спостерігають, чи
виділятиметься який-небудь газ (i), і чи відбудеться запалювання
цього газу (ii). Якщо газ спалахне, тоді подальше тестування
речовини непотрібне, оскільки така речовина вважається
небезпечною.
1.6.4. Етап 4
1.6.4.1. Прилад
Прилад налаштовують так, як показано на малюнку.
1.6.4.1. Умови тестування
Контейнер, в якому міститься тестована речовина, необхідно
перевірити на наявність будь-якого порошку < 500 мю m (розмір
частинок). Якщо порошок складає більше 1% від загальної кількості
складського варіанту, чи взятий зразок є ламким/крихким, тоді
перед проведенням тесту необхідно всю речовину перемолоти в
порошок для того, щоб зменшити розмір частинок під час зберігання
та користування; в іншому випадку речовину тестують такою, як є.
Тест проводять при кімнатній температурі (приблизно 20 град.С) та
атмосферному тиску.
1.6.4.3. Проведення тесту
У роздільну лійку приладу вливають 10-20 мл води та 10 г
речовини в колбу конусоподібної форми. Об'єм виділеного газу можна
виміряти будь-якими доступними методами. Потім відкривають кран
роздільної лійки, вода вливається у колбу, і засікають час на
секундомірі. Виділення газу вимірюють протягом семи годин. Якщо
протягом цього часу швидкість виділення газу непостійна або, якщо
по закінченні цього часу, швидкість збільшується, тоді час
вимірювання збільшують до максимум п'яти днів. Тестування
припиняють, якщо швидкість в будь-який момент зростає, з
розрахунку 1 літр/кг в годину. Тест повторюють тричі.
Газ необхідно дослідити, якщо його хімічні характеристики
невідомі. Якщо в газі виявлено сильнозаймисті компоненти та
невідомо, наскільки сильнозаймистою є вся суміш, необхідно
приготувати подібну суміш такого самого складу та перевірити її у
відповідності до методу А.11.
2. ДАНІ
Речовина вважається небезпечною, якщо:
- на будь-якому етапі проведення тесту відбувається спонтанне
спалахування,
або
- швидкість виділення вогненебезпечного газу більша 1 літр/кг
в годину.
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
За можливості, результати тесту мають включати наступну
інформацію:
- точну специфікацію речовини (характерні особливості та
домішки),
- інформацію про будь-яку попередню підготовку тестованої
речовини,
- результати тестів (етапи 1, 2, 3 та 4),
- хімічні особливості виділеного газу,
- швидкість виділення газу, якщо проводився етап 4 (1.6.4.),
- всі додаткові примітки щодо інтерпретації результатів.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Recommendations on the transport of dangerous goods, test
and criteria, 1990, United Nations, New York.
(2) NF T 20-040 (September 85) Chemical products for
industrial use. Determination of the flammability of gases formed
by the hydrolysis of solid and liquid products.

Додаток

Малюнок
Прилад
( 994_b14 )

А.13. ВЛАСТИВІСТЬ САМОЗАПАЛЕННЯ ТВЕРДИХ ТІЛ ТА РІДИН
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Даний метод тестування застосовується до твердих тіл або
рідин, які в невеликій кількості спалахують спонтанно - відразу
після контакту з повітрям при кімнатній температурі, наближеній до
20 град.С.
Даний метод тестування не розповсюджується на речовини, яким
для спалахування потрібно годинами та днями перебувати на повітрі
при кімнатній температурі або при температурі, що постійно
збільшується.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ
Вважається, що речовини мають властивості самозапалювання,
якщо вони спалахують або обвуглюються за умов, описаних в
пункті 1.6.
Може виникнути потреба у перевірці самозапалювання рідин
методом А.15. Температура самозапалювання (рідин та газів).
1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ
Не визначені.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Тверде тіло або рідина додається до інертного елементу та
вводиться в контакт з повітрям при температурі навколишнього
середовища протягом п'яти хвилин. Якщо рідини не спалахують, їх
кладуть для всмоктування на фільтрувальний папір та піддають дії
повітря при температурі навколишнього середовища (приблизно
20 град.С) на п'ять хвилин. У випадку, якщо тверде тіло або рідина
спалахує або від неї загорається/обвуглюється фільтрувальний
папір, тоді така речовина вважається самозапалюваною.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Повторюваність: у зв'язку із важливістю забезпечення безпеки
для визначення властивостей самозапалювання речовини, достатньо
отримання одного позитивного результату.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.6.1. Прилад
Фарфорова чашка, діаметром, приблизно, 10 см, заповнюється
діатомовою землею до 5 мм при кімнатній температурі (приблизно
20 град.С).
Примітка:
Діатомова земля або інша подібна інертна речовина, що, як
правило, завжди є в наявності, служить в якості ґрунту, на який
може випадково пролитись тестована речовина.
В наявності має бути фільтрувальний папір для тестування
рідин, які не загораються підчас контакту з повітрям або інертною
хімічною речовиною.
1.6.2. Проведення тесту
(а) Порошкоподібні речовини
1-2 куб.см тестованої речовини зсипають з майже метрової
висоти на негорючу поверхню, і спостерігають за тим, чи речовина
спалахне внаслідок цього, чи через п'ять хвилин після падіння.
Якщо спалахування не відбувається, тест проводять до шести
разів.
(b) рідини
Приблизно 5 куб.см тестованої рідини заливають в підготовлену
для цього фарфорову чашку та спостерігають, чи протягом 5 хвилин
відбудеться спалахування.
Якщо протягом шести разів не відбудеться спалахування,
необхідно провести наступні тести:
0.5 мл тестованого зразка через шприц випускають на
підготовлений фільтрувальний папір та спостерігають, чи в
результаті цього за протягом п'яти хвилин папір спалахне або
обвуглиться. Якщо не відбувається спалахування або обвуглення,
тест проводять до трьох разів.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Тестування припиняють після того, як в ході будь-якого з
тестів було досягнуто позитивних результатів.
2.2. ЕВАЛЮЮВАННЯ
У випадку, якщо речовина спалахує протягом п'яти хвилин після
того, як на неї подіяли повітря та інертна речовина, або від
рідини спалахує/обвуглюється фільтрувальний папір, тоді така
речовина вважається самозапалюваною.
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
За можливості,результати тестумають включати наступну
інформацію:
- точну специфікацію речовини (характерні особливості та
домішки),
- результати тестів,
- всі додаткові примітки щодо інтерпретації результатів.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) NF T 20-039 (September 85) Chemical products for
industrial use. Determination of the spontaneous flammability of
solids and liquids.
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test
and criteria, 1990, United Nations, New York.

А.14. ВИБУХОНЕБЕЗПЕЧНІСТЬ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Даний метод є схемою проведення тестування щодо визначення
того, чи тверде тіло або пастоподібна речовина буде
вибухонебезпечною, якщо перебуватиме в контакті з полум'ям
(перевірка теплочутливості), або, якщо така речовина піддається
удару чи тертю (перевірка на механічне подразнення). Метод також
перевіряє вибухонебезпечність рідини під дією полум'я або удару.
Метод складається з трьох частин:
(а) перевірка теплочутливості (1);
(b) перевірка на механічне подразнення від удару (1);
(c) перевірка на механічне подразнення від тертя (1).
Метод представляє дані щодо оцінки можливості виникнення
вибуху через певні загальні подразники. Даний метод не ставить за
мету визначити, чи речовина є вибуховою при будь-яких умовах.
Метод підходить для того, щоб визначити вибухонебезпечність
речовини (перевірка теплочутливості та механічного подразнення) за
певних умов, визначених директивою. В основі методу лежить
використання кількох типів приладів, які використовуються по
всьому світу (1), і які, зазвичай, показують значимі результати.
Загальновизнаним фактом є те, що самі методи не відіграють
віришального значення. Окрім спеціалізованих приладів
використовують й альтернативні, за умови, що вони визнані на
міжнародному рівні, а результати, відповідно, співвідносяться з
результатами, отриманими з використанням спеціалізованих приладів.
Тестування проводити непотрібно, якщо наявна інформація щодо
термодинаміки (наприклад, теплота розкладання) та/чи відсутність
певних груп реактивності (2) в структурній формулі безсумнівно
доводять, що речовина нездатна швидко розкладатись і при цьому
виділяти газ або тепло (тобто, матеріал не є вибухонебезпечним).
Для рідин не потрібно проводити тесту на механічне подразнення
(тертя).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ
Вибухонебезпечна речовина:
Речовини у спеціальному приладі можуть вибухнути під дією
полум'я або в результаті чутливості до удару чи тертя (або, якщо
мають більшу механічну чутливість, ніж 1.3 - динітробензол в
альтернативному приладі).
1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ
1,3-динітробензол, просіяний через фільтр до 0.5 мм технічний
продукт кристалічної структури, - для методів перевірки дії тертя
та удару.
Пергідро-1,3,5-тринітро-1,3,5-триазін (ВВД: вибухівка відділу
досліджень, гексоген, циклоніт - РСХ: Референтна служба по хімії
121-82-4), рекристалізовані з водного циклогексанону, проціджені
при 250 мю m, утримані на 150 мю m і висушені при температурі
103 +- 2 град.С (протягом чотирьох годин) - для другого ряду
тестів на тертя та дію електричного розряду.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Необхідно проведення попередніх тестів з метою визначення
безпечних умов проведення трьох тестів на чутливість.
1.4.1. Тести на безпечність експлуатації (3)
В цілях безпеки, перед проведенням основних тестів, беруть
зразки речовини у дуже малій кількості (приблизно 10 мг) і
піддають їх тепловій обробці, не обмежуючись і полум'ям, дією
удару в приладі будь-якої зручної форми, а також терттям: між
молотом та наковальнею або в іншій машині, де можна провести
тертя. Основне завдання тут полягає в тому, щоб визначити,
наскільки чутливою і вибухонебезпечною є речовина. Це необхідно
для того, щоб в ході проведення тестів на чутливість, особливо,
коли йдеться про визначення теплочутливості, можна було б
врахувати певні застереження, та оператор зміг уникнути ушкоджень.
1.4.2. Теплочутливість
Метод полягає в тому, що речовину нагрівають в металевій
трубці, отвори якої закриті вимірювальними діафрагмами з різним
діаметром дірки, для визначення здатності речовини вибухати при
інтенсивному нагріванні та певному утриманні частинок.
1.4.3. Механічне подразнення (удар)
У цьому методі тестування речовину піддають удару через
падіння певної визначеної маси з визначеної висоти.
1.4.4. Механічне подразнення (тертя)
Тверде тіло або пастоподібну речовину піддають тертю між
звичайними поверхнями при певному навантаженні та русі.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Не вказано.
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Теплочутливість (під дією полум'я)
1.6.1.1. Прилад
Прилад для проведення тестування складається з одноразової
металевої трубки та закриву багаторазового використання
(див. малюнок 1), які вмонтовуються в захисний нагрівальний
пристрій. Кожна трубка виготовлена з тонколистової сталі
(див. Додаток) і має діаметр 24 мм, довжину 75 мм та товщину
стінок 0.5 мм. Отвір для відкривання трубки має закручувальну різь
для діафрагми. Це стійка до стискання діафрагма з діркою
посередині, яка щільно пристає до трубки за допомогою
двостороннього гвинтового з'єднання (гайка/муфта та кільце з
внутрішньою різьбою). Гайка та кільце з внутрішньою різьбою
виготовлені з хромо-марганцевої сталі (див. Додаток), стійкої до
нагрівання - 800 град.С. Діафрагми товщиною 6 мм виготовляються з
теплостійкої сталі (див. Доповнення) та мають різні діаметри
відкривання.
1.6.1.2. Умови проведення тесту
Зазвичай, речовину тестують, як є, хоча в деяких випадках,
наприклад, коли її розмір зменшено завдяки порізці чи пресуванню,
таку речовину тестують після подрібнення.
Що стосується твердих тіл, то їх маса для проведення кожного
окремого тестування визначається методом пробного прогону в два
етапи. Сама трубка заповнюється 9 куб.см речовини та речовиною,
набитою при силі 80 Н, що застосовується до всієї перехресної
форми трубки. В цілях безпеки або, якщо фізична форма зразка
речовини змінюється методом компресії, необхідно застосовувати
інші методи заповнення трубки; наприклад, якщо речовина надто
чутлива до тертя, тоді метод набивання не підходить. Якщо ж
матеріал такий, що піддається стисканню/компресії, тоді його можна
добавляти у більшій кількості і набивати трубку до 55 мм від
верху. При набиванні трубки до 55 мм визначається загальна маса
основної речовини, і додаються два наступні інкременти, які
набиваються силою 80 Н кожен. Потім набивають матеріал або, якщо
необхідно, виймають, таким чином, щоб трубка була забитою тільки
до 15 мм від верху. Другий пробний прогін проводять при кількості
набитої речовини 1/3 від загальної маси речовини першого погону.
Ще два цих інкременти додають при силі набивання 80 Н, а рівень
речовини в трубці повинен становити до 15 мм від верху - методом
додавання або віднімання матеріалу, в залежності від необхідності.
Для кожного експерименту беруть кількість речовини, визначену в
ході другого пробного прогону; набивання відбувається трьома
рівними частинами, кожну з яких спресовують до 9 куб.см,
використовуючи будь-яку необхідну силу. (Полегшити процес можна
застосувавши розпіркові кільця).
Рідини та гелі вводять в трубку на висоту до 60 мм. Особливої
обережності потребують гелі, щоб уникнути утворення вакууму.
Кільце з внутрішньою різзю просувають в трубку знизу, вставляють
діафрагму з відповідним отвором і затягують гайку, попередньо
змазавши її дисульфідом молібдену. Дуже важливо перевірити, чи не
застрягає речовина між крайкою трубки та діафрагмою або у різі.
Нагрівання відбувається пропаном з технічного циліндру, що
має регулюючий клапан (60-70 мбар), і далі тепло за допомогою
мірки через колектор рівномірно розподіляють до чотирьох горілок.
Горілки розміщені довкола барокамери, як показано на мал. 1.
Загальна витрата палива чотирьох горілок становить 3,2 літра
пропану в хвилину. Можна використовувати альтернативні горілки та
паливні гази, але швидкість нагріву повинна бути такою, як
показано на мал. 3. У всіх приладах необхідно перевіряти швидкість
нагріву, використовуючи трубки, заповнені дибутилфталатом, як
вказано на мал. 3.
1.6.1.3. Проведення тестів
Кожен тест проводять до тих пір, поки трубка не розколиться
на шматки або ж нагрівають трубку до п'яти хвилин. Тест, в
результаті якого трубка розколюється на три і більше шматків, які
іноді між собою з'єднані смужками металу, як показано на мал. 2,
вважається підтвердженням вибуху. Якщо ж по завершенню тесту
трубка розколюється на менше шматків або не розколюється взагалі,
тоді це не вважається вибухом.
Спочатку проводять серію з трьох тестів, використавши
6-ти міліметрову діафрагму, і, якщо не виявлено вибухів, проводять
другу серію з трьох тестів, використовуючи діафрагму з діаметром
2,00 мм. Якщо в ході однієї з серій тестів відбувається вибух,
тоді подальші випробовування непотрібні.
1.6.1.4. Оцінка
1.6.1.5. Результат тестування вважається позитивним, якщо в
ході однієї з серій тестів відбувається вибух.
1.6.2. Перевірка на механічне подразнення (удар)
1.6.2.1. Прилад (мал. 4)
Основними частинами типового приладу з падаючим молотом є
блок сталевої конструкції на платформі, ковадло, колонка,
направляючі, падаючий вантаж, спусковий пристрій та тримач зразка
для тестування. Сталеве ковадло (100 мм діаметром х 70 мм висотою)
прикручується до верху стального блоку (230 мм довжиною х 250 мм
шириною х 200 мм висотою) на платформі (450 мм довжиною х 450 мм
шириною х 60 мм висотою). Зроблена з цільного куска сталевого
шматка колонка має захисний патрон, який прикручується до задньої
стінки сталевого блоку. Чотирма шурупами прилад прикручується до
бетонної основи (60 x 60 x 60 см) таким чином, щоб направляючі
рейки були у вертикальному положенні, і вантаж міг вільно падати.
В наявності повинні бути 5-ти та 10-ти кілограмові вантажі,
зроблені з твердої сталі. Ударний наконечник кожного вантажу має
бути з гартованої сталі, мати мінімальний діаметр 25 мм, і
твердість по шкалі С Роквелла має становити 60-63.
Зразок речовини для тестування поміщається в ударний
пристрій, що складається з двох одновісних циліндрів, виготовлених
з твердої сталі, розміщених один над одним в циліндричному
сталевому направляючому кільці. Одновісні циліндри з твердої сталі
повинні мати такі розміри: 10 (- 0,003, - 0,005) мм в діаметрі та
10 мм висоти, поверхні мають бути відполіровані та із
заокругленими краями (радіус викривлення 0,005 мм), твердість по
шкалі С Роквелла становитиме 58-65. Зовнішній діаметр порожнього
циліндра становитиме 16 мм, відполірований отвір 10 (+ 0,005,
+ 0,010) мм і висота 13 мм. Ударний пристрій встановлюється на
допоміжному ковадлі (26 мм діаметром та 26 мм висотою),
виготовленого зі сталі та відцентрованого за допомогою
направляючого кільця з отворами для випаровування диму/газів.
1.6.2.2. Умови тестування
Об'єм тестованого зразка має бути 40 куб.мм або таким, щоб це
відповідало розмірам альтернативного приладу. Речовини тестують в
сухому вигляді та готують наступним чином:
(а) порошкоподібні речовини просіюють (розмір просіювання
ситом 0,5 мм); всі частинки, пропущені крізь сито,
використовуються для тестування;
(b) спресовані, відлиті чи іншим чином ущільнені речовини
розламують на малі шматки та просіюють; просіяну частинку
діаметром 0.5-1 мм використовують для тестування в якості вихідної
речовини.
Пастоподібні речовини, за можливості, тестують в сухому
вигляді або в будь-якому випадку, після того, як буде усунено
якомога більше розчинника. Рідини тестують при одноміліметровому
зазорі між верхнім та нижнім сталевими циліндрами.
1.6.2.3. Проведення тестувань
Проводиться серія з шести тестів, в ході яких з висоти 0.40 м
(40J) кидають вантаж масою 10 кг. Якщо при 40J відбувається вибух,
тоді проводиться наступна серія з шести тестів, в ході яких з
висоти 0.15 м (7,5J) кидають вантаж масою 5 кг. У випадку
використання інших приладів для тестування зразок порівнюють з
обраною основною речовиною, відповідно до визначеного методу
(наприклад, вертикальними зворотно-поступальними рухами, тощо).
1.6.2.4. Оцінка результатів
Результат тесту вважається позитивним, якщо вибух (розрив в
полум'я і/або доповідь результатів еквівалентна вибуху)
трапляється хоча б один раз в будь-якому з тестів, використовуючи
відповідний ударний пристрій, чи, якщо зразок чутливий більше
1,3-динітробензолу, чи ВВД в альтернативному тесті на удар.
1.6.3. Перевірка на механічне подразнення від тертя
1.6.3.1. Прилад (мал. 5)
Прилад для перевірки тертя складається з відлитої сталевої
платформи, на яку кріпиться пристрій тертя. Він складається з
циліндричного фарфорового стрижня та рухомої фарфорової посудини,
яка рухається в двох напрямках на каретці. Каретка під'єднується
до електромотору за допомогою шатунного механізму, ексцентрикового
кулачка та відповідного механізму, щоб посудина рухалась, лише
раз, вперед і назад під стрижнем на відстань 10 мм. Навантаження
на фарфоровий стержень має бути, наприклад, 120 або 130 Ньютонів.
Фарфорові посудини плоскої форми виготовляють з білого
технічного фарфору (нерівність поверхні 9-32 мю m) та вони мають
такі розміри: 25 мм (довжини) x 25 мм (ширини) x 5 мм (висоти).
Циліндричний фарфоровий стрижень також виготовляють з білого
технічного фарфору завдовжки 15 мм, діаметром 10 мм. Стрижень має
шорстку необроблену поверхню, радіус його заокруглення становить
10 мм.
1.6.3.2. Умови проведення тесту
Об'єм тестованого зразка повинен бути 10 куб.мм або таким,
щоб це відповідало розмірам альтернативного приладу.
Речовини тестують в сухому вигляді та готують наступним
чином:
(а) порошкоподібні речовини просіюють (розмір просіювання
ситом 0,5 мм); всі частинки, пропущені крізь сито,
використовуються для тестування;
(b) спресовані, відлиті чи іншим чином ущільнені речовини
розламують на малі шматки та просіюють; просіяну частинку
діаметром < 0.5 мм використовують для тестування.
Пастоподібні речовини, за можливості, тестують в сухому
вигляді. Якщо речовину неможливо приготувати в сухому стані, тоді
в пастоподібному стані (після того, як буде усунено якомога більше
розчинника) її тестують при таких розмірах: 0,5 мм товщини, 2 мм
ширини, 10 мм довжини.
1.6.3.3. Проведення тестувань
Фарфоровий стрижень опускають на зразок речовини, відповідно
до обраного тесту та навантаження. В процесі виконання тесту
необхідно, щоб пористі позначки фарфорової посудини лежали
навхрест відносно напрямку руху. Необхідно прослідкувати, щоб в
момент, коли стрижень опускається на посудину, в ній було
достатньо речовини, і щоб посудина під стрижнем правильно
рухалась. У випадку тестування пастоподібних речовин
використовують вимірювальний прилад 0,5 мм товщиною з отвором
2 х 10 мм для подачі речовини в посудину. Фарфорова посудина
повинна рухатись на 10 мм вперед-назад під стрижнем з частотою
0,44 секунди. Кожна частина поверхні посудини та стрижня повинні
використовуватись лише один раз; два кінці кожного стрижня мають
служити для двох тестувань, а дві поверхні посудини - для трьох
спроб кожна.
Проводиться серія з шести тестів при навантаженні 360 Н. Якщо
внаслідок цього буде отримано позитивний результат, наступна серія
з шести тестів проводитиметься при навантаженні 120 Н. У випадку
використання інших приладів для тестування зразок порівнюють з
обраною основною речовиною, відповідно до визначеного методу
(наприклад, вертикальними зворотно-поступальними рухами, тощо).
1.6.3.4. Оцінка результатів
Результат тесту вважається позитивним, якщо вибух
(потріскування та/чи розрив в полум'я еквівалентні вибуху)
трапляється хоча б один раз в будь-якому з тестів, використовуючи
відповідний пристрій для тертя, чи, якщо результат тестування
відповідає еквівалентним критеріям альтернативного тесту на тертя.
2. ДАНІ
В принципі, згідно визначень директиви, речовина вважається
вибухонебезпечною тоді, коли в результаті проведення тестів на
удар, термообробку і тертя, отримано позитивний результат.
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
3.1. ЗВІТ ПРО ТЕСТ
За можливості, результати тесту мають містити наступну
інформацію:
- специфікацію речовини, її склад, відсутність домішок, вміст
вологи, тощо,
- фізичну форму зразка, інформацію про те, чи він був
подрібнений, розламаний та/чи просіяний,
- спостереження під час перевірки речовини на теплочутливість
(наприклад, маса зразка, кількість уламків/фрагментів),
- спостереження під час перевірки речовини на механічне
подразнення (наприклад, утворення значної кількості диму або
повний розклад без звуку, полум'я, іскор, потріскування, тощо),
- результати по кожному типу тесту,
- якщо використовувався альтернативний прилад - наукове
обґрунтування його доцільності, а також підтвердження
співвідношення між результатами, отриманими з спеціалізованого
приладу із результатами, отриманими з альтернативного приладу,
- будь-які важливі коментарі, тип посилання на результати
тестувань подібних виробів, що може бути важливим для правильної
інтерпретації результатів,
- усі додаткові зауваження щодо інтерпретації результатів.
3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ ТА ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Звіт про тестування має містити інформацію про будь-які
результати, що вважаються неправильними, ненормальними чи
нехарактерними для такого експерименту. Якщо будь-які з
результатів необхідно зменшити, тоді необхідно представити
відповідне пояснення та результати альтернативного або додаткового
тестування. Якщо неправильний результат тесту неможливо пояснити,
тоді його беруть за номінальне значення та, відповідно,
використовують для класифікації речовини.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods:
Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards,
4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe,
1961, vol. 3, 6-13 and 30-42.
(4) NF T 20-038 (September 85) Chemical products for
industrial use - Determination of explosion risk.

Додаток

Приклад специфікації
матеріалу для тесту на теплочутливість
(див. НІС 1623)
(1) Трубка: Специфікація матеріалу N 1.0336.505 г.
(2) Діафрагма: Специфікація матеріалу N 1.4873
(3) Кільце з внутрішньою різзю та гайка: Специфікація
матеріалу N 1.3817

Малюнок 1
( 994_b14 )

Малюнок 2
( 994_b14 )

Малюнок 3
( 994_b14 )

Малюнок 4
( 994_b14 )

Малюнок 5
( 994_b14 )

А.15. ТЕМПЕРАТУРА САМОЗАПАЛЕННЯ (РІДИНИ ТА ГАЗИ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Вибухонебезпечні речовини, а також ті речовини, які
самозапалюються від контакту з повітрям при температурі
навколишнього середовища, не підлягають даному тестуванню. Така
методика тестування застосовується до газів, рідин та випарів, які
за наявності повітря спалахують від гарячої поверхні.
Температуру самозапалювання можна значно знизити за допомогою
каталітичних домішок, матеріалом поверхні чи більшим об'ємом
посудини тестування.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
Рівень самозапалювання виражається елементами вимірювання
температури самозапалювання. Температура самозапалювання - це
найнижча температура, при якій речовина спалахує від контакту з
повітрям за умов, визначених у методі тестування.
1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ
Базові речовини зазначені в стандартах, поданих в
пункті 1.6.3, які головним чином служать для перевірки проведення
методу час від часу та можливості порівняння результатів з іншими
методами.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Метод визначає мінімальну температуру внутрішньої поверхні
корпусу, яка призводить до спалахування впорскнутих в нього газу,
випарів або рідини.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Повторюваність змінюватиметься в залежності від рівнів
температури та застосовуваного методу тестування.
Чутливість та специфічні особливості залежать від
застосовуваного методу тестування.
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Прилад
Прилад описано в методі, посилання на який подано в
пункті 1.6.3.
1.6.2. Умови тестування
Зразок речовини тестують із використанням методу, посилання
на який подано в пункті 1.6.3.
1.6.3. Проведення тесту
Див. МЕК 79-4, HIC 51794, AABM-E 659-78, BS 4056,
NF T 20-037.
2. ДАНІ
Внесення даних щодо температури тестування, атмосферного
тиску, кількості взятого зразка та проміжку часу до моменту
спалахування.
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
За можливості, результати тесту мають містити наступну
інформацію:
- Опис субстанції, її склад, відсутність домішок,
- Кількість використаного зразка, атмосферного тиску,
- Прилад, який застосовувався,
- Результати вимірювань (температура в ході тестів,
результати запалювання, середній час, потрібний молекулі, щоб
пройти крізь колонку (час простою)),
- Усі додаткові зауваження щодо інтерпретації результатів.
4. ПОСИЛАННЯ
Немає.
А.16. ВІДНОСНА ТЕМПЕРАТУРА САМОЗАПАЛЕННЯ
ДЛЯ ТВЕРДИХ ТІЛ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Вибухонебезпечні речовини, а також ті речовини, які
самозапалюються від контакту з повітрям при температурі
навколишнього середовища, не підлягають даному тестуванню.
Метою даного тестування є надання попередньої інформації щодо
самозапалювання твердих тіл при визначених температурних режимах.
Якщо тепло, яке виникає в процесі реакції речовини та кисню
або в результаті екзотермічного розпаду, не зникає досить швидко в
середовищі, тоді самонагрівання призводить до самозапалювання.
Відповідно, самозапалювання відбувається тоді, коли швидкість
нагрівання перевищує швидкість переохолодження.
Такий метод тестування може застосовуватись в якості
попереднього скрінінг - тесту для твердих тіл. Враховуючи складні
особливості процесу запалювання та горіння твердих тіл,
температура самозапалювання, що визначається за допомогою даного
методу тестування, використовується лише в порівняльних цілях.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
Температура самозапалювання - це найнижча температура
навколишнього середовища по Цельсію, при якій певна кількість
речовини спалахує від контакту з повітрям за умов, визначених
методом тестування.
1.3. БАЗОВА РЕЧОВИНА
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
При кімнатній температурі певну кількість речовини кладуть в
піч; крива залежності від температури/часу, що вказує на стан
всередині зразка, записується в той момент, коли температура
всередині печі сягає 400 град.С або, якщо вона є нижчою,- це має
бути температура плавлення зі швидкістю 0,5 град.С/хвилину. В
даному тесті температура печі, при якій тестований зразок
нагрівається до 400 град.С методом самозапалювання, називається
температурою самозапалювання.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Прилад
1.6.1.1. Піч
Використовується лабораторна піч із запрограмованою
температурою (об'ємом 2 літри), обладнана системою циркуляції
природного повітря та системою виведення вихлопів. З метою
уникнення потенційно можливого вибуху, гази розпаду не повинні
контактувати з елементами електронагріву.
1.6.1.2. Куб з жорсткої арматурної сітки
Арматурну сітку з нержавіючої сталі з отворами в 0,045 мм
необхідно порізати так, як показано на мал. 1. Сітку складають та
скріплюють дротом у вигляді куба з верхнім отвором.
1.6.1.3. Термостовпчики
Звичайні, придатні для використання термостовпчики.
1.6.1.4. Записуючий пристрій
Будь-який двоканальний записуючий пристрій, відкалібрований в
межах 0-600 град.С або звичайної напруги.
1.6.2. Умови проведення тесту
Речовини тестують, як є.
1.6.3. Проведення тесту
Куб заповнюють речовиною для тестування і акуратно струшують,
додаючи в нього речовину до верху, заповнивши таким чином всю
посудину. Далі, куб підвішують в центрі печі при кімнатній
температурі. Один з термостовпчиків ставлять в центрі куба, а
інший між стінками куба та печі, щоб можна було записати
температуру печі.
Температуру печі та зразка постійно записують, поки
температура всередині печі не досягне 400 град.С або, якщо вона є
нижчою, - це має бути температура плавлення зі швидкістю
0,5 град.С/хвилину.
Коли речовина спалахує, термостовпчик повинен показати різке
збільшення температури порівняно з температурою печі.
2. ДАНІ
Для оцінювання підходить температура печі, при якій зразок
речовини самонагрівається до 400 град.С (див. малюнок 2).
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
За можливості, результати тесту мають містити наступну
інформацію:
- Опис субстанції/речовини, що є предметом тестування,
- Результати вимірювань, включаючи криву залежності від
температури/часу,
- Усі додаткові зауваження щодо інтерпретації результатів.
4. ПОСИЛАННЯ
NF T 20-036 (September 85) Chemical products for industrial
use. Determination of the relative temperature of the spontaneous
flammability of solids.

Малюнок 1
( 994_b14 )

Малюнок 2
( 994_b14 )

А.17. ВЛАСТИВОСТІ ОКИСЛЕННЯ (ТВЕРДІ ТІЛА)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Необхідно мати попередню інформацію щодо потенційних
вибухонебезпечних властивостей речовини до проведення тестування.
Даний тест не застосовується до рідин, газів,
вибухонебезпечних та вогненебезпечних речовин або органічних
окислювачів.
У випадку, якщо дослідження структурної формули показують, що
речовина не піддається екзотермічній реакції з горючою речовиною,
даний тест не проводять.
Необхідність в проведенні попереднього тестування виникає
тоді, коли потрібно визначити доцільність проведення самого тесту.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
Час горіння: час реакції (виражається в секундах), що
надається реакційній зоні для проходження по стовпчику речовини,
відповідно до методу, описаного в пункті 1.6.
Швидкість горіння: виражається в міліметрах/секунду.
Максимальна швидкість горіння: найвищий показник швидкості
горіння, отриманий з сумішей, які містять 10-90% окислювачу.
1.3. БАЗОВА РЕЧОВИНА
Для проведення, як основного, так і попереднього тестування,
в якості базової речовини використовують барій нітрат найвищої
якості.
Базова суміш - це суміш барій нітрату з порошкоподібною
целюлозою, приготовленого відповідно до пункту 1.6, що має
максимальну швидкість горіння (як правило, це суміш з вмістом
барію нітрату 60%).
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
В цілях безпеки проводять попередній скрінінг - тест. Якщо
такий попередній скрінінг - тест показує, що речовина має
окислювальні властивості, тоді подальше тестування непотрібно. В
іншому випадку є необхідність проведення повного тестування.
Під час проведення повного тестування в різних пропорціях
змішують саму речовину та зазначену вибухонебезпечну речовину.
Далі, кожну суміш формують у вигляді стовпчика, який з одного
кінця підпалюють. Визначена максимальна швидкість горіння
порівнюється з максимальною швидкістю горіння базової суміші.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
У випадку необхідності застосовують будь-який метод
подрібнення та змішування, але за умови, щоб різниця в
максимальній швидкості горіння з шести окремих тестів відрізнялась
від середнього арифметичного значення не більше, ніж на 10%.
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Підготовка
1.6.1.1. Речовина для тестування
Необхідно зменшити зразок речовини до розміру частинок
< 0,125 мм, застосувавши такий метод: просіяти речовину,
перемолоти решту шматків, повторити процедуру до повного
просіювання.
Можна застосовувати будь-який з методів подрібнення та
просіювання, якщо вони відповідають критеріям якості.
Перед приготуванням суміші речовину висушують при температурі
105 град.С до отримання постійної ваги. У випадку, якщо
температура розпаду речовини є нижчою 105 град.С, речовину
потрібно просушити при відповідній нижчій температурі.
1.6.1.2. Вогненебезпечна речовина
В якості вогненебезпечної речовини використовують
порошкоподібну целюлозу. Це має бути целюлоза для тонкошарової або
колонкової хроматографії. Целюлозний зразок, в якому довжина
волокон є більшою 85% між 0,020 та 0,075 мм, вважається таким, що
підходить для тесту. Целюлозний порошок пропускають крізь сито з
розміром вічок в 0,125 мм. Таку ж партію целюлози слід
використовувати в ході проведення тесту.
Перед приготуванням суміші порошкоподібну целюлозу висушують
при температурі 105 град.С до отримання постійної ваги.
Якщо під час проведення попереднього тесту використовують
борошно грубого млива, необхідно зібрати м'яке борошно, що
проходить крізь вічка сита товщиною 1,6 мм, потім добре
перемішати, просушити при температурі 105 град.С протягом чотирьох
годин так, щоб товщина шару борошна була не більшою 25 мм.
Просушене та охолоджене борошно зберігають в герметично закритому
контейнері, заповненому до максимуму, впродовж 24 годин.
1.6.1.3. Джерело запалювання
В якості джерела запалювання використовують гаряче полум'я з
газової горілки, мінімальною товщиною 5 мм. При використанні
іншого джерела запалювання (наприклад, під час проведення тесту в
умовах інертної атмосфери) необхідно повідомляти про хід
експерименту та доцільність його проведення.
1.6.2. Проведення тестування
Примітка:
Особливу увагу та обережність слід виявляти у випадку
застосування сумішей окислювачів з целюлозою чи борошном грубого
млива, які вважаються потенційно вибухонебезпечними.
1.6.2.1. Попередній скрінінг - тест
Речовина змішується належним чином із сухою целюлозою чи
борошном грубого млива в пропорції: 2 (тестована речовина) до
1 (целюлоза або борошно грубого млива) на вагу. Далі суміш за
допомогою спеціальної форми, не сильно втрамбовуючи, викладають у
вигляді маленької конусоподібної гірки, розміри якої становить
3,5 см (діаметр основи) х 2,5 см (висота). В якості форми можна
використовувати лабораторну скляну лійку, яка закривається
пробкою.
Сформовану конусоподібну гірку викладають на холодній,
непористій платформі з низькою теплопровідністю та нездатністю до
спалахування. Тестування проводять у витяжній шафі, відповідно до
пункту 1.6.2.2.
До гірки з речовиною підводять джерело запалювання. Ведуться
спостереження та записуються показники щодо сили та тривалості
результату реакції.
Якщо достатня сила реакції, тоді речовина вважається
окислювальною.
У випадку, якщо є сумніви щодо результатів реакції, тоді
необхідно провести тестування "поїздом".
1.6.2.2. Тестування "потягом"
Необхідно приготувати суміші окислювача з целюлозою, де вміст
окислювача на вагу становить 10-90% в 10% інкрементах. В граничних
випадках використовують суміші проміжного окислювача з целюлозою,
щоб отримати якомога точнішу максимальну швидкість горіння.
Речовину формують у вигляді стовпчика за допомогою
спеціальної металевої прес-форми завдовжки 250 мм, з поперечним
перерізом трикутної форми, внутрішньою висотою 10 мм та шириною
20 мм. По обидва боки прес-форми повздовж кріпляться два металевих
листи, що слугують своєрідними боковими обмежувачами і виступають
на 2 мм за верхній край поперечного перерізу трикутної форми
(див. малюнок). Таку конструкцію довільно заповнюють сумішшю з
невеликим надлишком. Після того, як прес-форму один раз кинули на
тверду суху поверхню з висоти 2 см, надлишок суміші акуратно
зчищають аркушем паперу, тримаючи його під нахилом. (Така
процедура кидання та зчищання проводиться для вирівнювання суміші
у формі). Потім забирають бокові обмежувачі, а решту суміші
розгладжують за допомогою валика. Далі, поверху прес-форми кладуть
непористу платформу з низькою теплопровідністю та нездатністю до
спалахування. Після цього таку конструкцію перевертають, а
пресформу забирають.
Розташуйте стовпчик з сумішшю в поперечному до протягу
напрямку у витяжній шафі.
Швидкість повітря в ході тесту має бути незмінною, а також
такою, щоб унеможливити вихід димів та газів у лабораторію.
Довкола всього пристрою піднімають захисний щит від протягу.
Враховуючи те, що деякі речовини та целюлоза є
гігроскопічними (тобто, вбирають вологу), тестування необхідно
проводити якомога швидко.
Один край стовпчика із сумішшю запалюють від полум'я.
Після того, як зона реакції поширилась на початкову
30-тиміліметрову відстань, необхідно заміряти час реакції на
200 мм.
Тестування проводять із базовою сумішшю, і, щонайменше, один
раз з сумішшю із целюлозою.
У випадку, якщо максимальна швидкість горіння виявиться
набагато більшою, ніж швидкість горіння базової суміші, тестування
можна зупинити; в іншому випадку тест потрібно повторювати по
5 хвилин для кожної з трьох сумішей, задаючи при цьому найбільшу
швидкість горіння.
Якщо ж є підозра того, що отриманий результат є помилковим,
тоді експеримент повторюють, використовуючи інертну речовину з
подібним розміром часток, наприклад, кізельгур, замість целюлози.
В якості альтернативи, речовина з целюлозою, маючи найбільшу
швидкість горіння, підлягає повторному тестуванню в інертній
атмосфері (< 2% v/v вміст кисню).
2. ДАНІ
В цілях безпеки необхідно брати до уваги максимальну
швидкість горіння (не середній показник), як швидкість, що є
характерною для окислювальних властивостей тестованої речовини.
Для оцінки швидкості підходить найвищий показник швидкості
горіння, отриманий в результаті серії з шести тестів.
Побудуйте графік, на якому буде показано найвищий показник
швидкості горіння по кожній суміші в залежності від концентрації
окислювача. На основі графіка отримайте максимальну швидкість
горіння.
Шість вирахуваних показників швидкості горіння однієї серії,
отриманих із суміші з максимальною швидкістю горіння, не повинні
відрізнятись від арифметичного середнього показника більше, ніж на
10%; в іншому ж випадку необхідно вдосконалити методи подрібнення
та змішування речовини.
Порівняйте отриману максимальну швидкість горіння з
максимальною швидкістю горіння базової суміші (див. пункт 1.3).
Якщо тестування проводять в інертній атмосфері, максимальна
швидкість реакції порівнюється з швидкістю реакції базової суміші
в інертній атмосфері.
3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
3.1. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ
За необхідністю, результати тестування мають містити наступну
інформацію:
- точну специфікацію речовини, склад, відсутність домішок,
вміст вологи, тощо,
- обробку зразка тестованої речовини (наприклад, подрібнення,
висушування),
- джерело запалювання, яке використовується в ході
тестування,
- результати вимірювань,
- режим/стан реакції (наприклад, спалахування поверхні
речовини, прогорання крізь цілу суміш, будь-яка інформація щодо
продуктів горіння, тощо),
- всі додаткові зауваження щодо інтерпретації результатів,
включаючи опис сили та енергії (полум'я, спалахування,
випаровування диму/газів, повільне тління, тощо), а також
інформація про приблизну тривалість процесу на прикладі
попереднього скрінінг - тесту, як для тестованої, так і для
базової речовини,
- результати тестів інертної речовини, за наявності,
- результати тестів в інертній атмосфері, за наявності.
3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Речовину вважають такою, що має окислювальні властивості,
якщо:
(а) в ході проведення попереднього скрінінг - тесту виникає
сильна реакція;
(b) в ході проведення повномасштабного тесту буде виявлено,
що швидкість горіння протестованих сумішей є більшою від (або
дорівнює) максимальної швидкості горіння базової суміші целюлози
та барію нітрату.
Для того, щоб уникнути помилкових результатів тесту, під час
інтерпретації результатів необхідно враховувати процес тестування
інертного матеріалу та/або тестування в умовах інертної атмосфери.
4. ПОСИЛАННЯ
NF T 20-035 (September 85) Chemical products for industrial
use. Determination of the oxidising properties of solids.

Додаток

Малюнок
( 994_b14 )

А.18. СЕРЕДНЯ МОЛЕКУЛЯРНА МАСА
ТА МОЛЕКУЛЯРНО-МАСОВИЙ РОЗПОДІЛ ПОЛІМЕРІВ
1. МЕТОД
Метод гельпроникаючої хроматографії є повторенням
ОЕСР ТІ ((1996). Основні принципи та подальша технічна інформація
подається в посиланні(1).
1.1. ВСТУП
Враховуючи те, що властивості полімерів досить різноманітні,
тому неможливо описати один окремий метод, який би визначав умови
для розподілу та оцінки, що розповсюджуються на всі можливі
особливості та специфіку розподілення полімерів. Особливо це
стосується систем складних полімерів, які не піддаються методу
гельпроникаючої хроматографії (ГПХ). Таким чином, коли не вдається
провести метод ГПХ, молекулярну масу можливо визначити за
допомогою інших методів (див. Додаток). У таких випадках необхідно
надати повну інформацію щодо деталей та доцільності
застосовуваного методу.
Описаний метод оснований на Стандарті HIC 55672 (1). Детальну
інформацію щодо того, як проводити експерименти та оцінювати дані,
можна знайти в цьому Стандарті HIC. Якщо необхідно змінити умови
експериментів, необхідно подати інформацію щодо доцільності таких
змін. Також, можна застосовувати інші стандарти, якщо на них є
відповідні посилання. В описаному методі для калібрування
використовуються зразки полістиролу певної полідисперсності. В
методі можливі зміни, якщо це необхідно для певних полімерів,
наприклад, у випадку з водорозчинними та довголанцюговими
полімерами.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ
Середньочислова молекулярна маса М та середньомасова
n молекулярна маса М визначаються наступними рівняннями:
w
n n
S H S H x M
i=1 i i=1 i i
M = ---------- M = --------------- n n w n
S H /M S H
i=1 i i i=1 i
де Н - рівень сигналу детектора від основної лінії для
i об'єму утримування V ,
i
M - молекулярна маса частки полімеру при об'ємі утримування i V та n - точка вводу даних.
i
S - знак суми.
Ширина розподілення молекулярної маси, що є показником
дисперсності системи, задається у співвідношенні М /М .
w n
1.3. БАЗОВІ СУМІШІ
Оскільки метод ГПХ є досить відносним, тому необхідно
проводити калібрування. Для цього, як правило, використовують
зразки полістиролу певної середньої молекулярної маси М та М та
n w розподільної маси. Зразки викладають вузькими смужками в лінію.
Калібрувальна крива застосовується лише для визначення
молекулярної маси невідомого зразка, якщо умови розподілу пробних
та основних зразків визначались індивідуально.
Визначений взаємозв'язок між молекулярною масою та об'ємом
елюювання допускається лише за певних умов в окремо взятому
експерименті. Перш за все, такі умови включають температуру,
розчинник (або розчинювальну суміш), хроматографічні умови та
колонку розподілу або систему колонок.
Таким чином, показники молекулярної маси визначеного зразка -
це лише відносні показники, які характеризуються, як "відносні
показники молекулярної маси полістиролу". Це означає, що, в
залежності від тих структурно-хімічних відмінностей, які існують
між пробними та основними зразками, показники молекулярної маси
можуть більш-менш відхилятись від абсолютних показників. Якщо
використовуються інші основні зразки, наприклад,
поліетиленгліколь, поліетилен оксид, поліметилметакрилат,
поліакрилова кислота, тоді необхідно обумовити доцільність їх
застосування.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
За допомогою методу ГПХ можна визначити, як розподілення
молекулярної маси зразка, так і показники середньої молекулярної
маси (М та М ). Метод ГПХ - це особливий вид рідинної
n w хроматографії, в якому зразок розподіляють у відповідності до
гідродинамічного об'єму окремих компонентів(2).
Розподіл відбувається тоді, коли зразок проходить крізь
колону, заповнену пористим матеріалом, як правило, органічним
гелем. Молекули малих розмірів проходять крізь пори, на відміну
від великих, які затримуються. Таким чином, ланцюг з великих
молекул є коротшим, і вони елююються першими. Молекули середніх
розмірів проходять крізь деякі пори та елююються пізніше. Найменші
молекули, чий гідродинамічний радіус менший за розмір гелевих пор,
можуть пройти крізь усі пори. Такі молекули елююються останніми.
В ідеальному варіанті повинно бути так, щоб на розподіл
повністю впливав розмір різновидів молекул, але на практиці досить
важко уникнути хоча б деяких ефектів поглинання. Погіршити
ситуацію можуть нерівно запакована колонка та недіючий об'єм (2).
Виявити поглинання можна за допомогою, наприклад, індексу
рефракції або ультрафіолетового випромінювання. Результати
відображаються на звичайній кривій розподілу. Проте, для того, щоб
на цій кривій відобразити фактичні показники молекулярної маси,
необхідно відкалібрувати колонку на прикладі полімерів визначеної
молекулярної маси і, в ідеальному варіанті, майже подібної
структури, наприклад, різних зразків полістиролу. Йдеться про
типові результати на кривій Гауса, які мають відхилення через
невелику криву розподілення в бік низької молекулярної ваги;
вертикальна вісь показує кількість на вагу різних молекулярних
різновидів, які є предметом елюювання, а горизонтальна -
логарифмічну молекулярну вагу.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Повторюваність (Відносне стандартне відхилення: ВСВ) об'єму
елюювання має бути більшою за 0,3%. Необхідно перевірити
повторюваність аналізу через внутрішній зразок, якщо оцінка
хроматограми залежить від часу та не відповідає вищезгаданому
критерію (1). Полідисперсність залежить від молекулярної ваги
зразків. Типовими показниками для стандартних зразків полістиролу
є такі:
M < 2 000 M /M < 1,20
p w n
6
2 000 <= M <= 10 M /M < 1,05
p w n
6
M > 10 M /M < 1,20
p w n
(М -молекулярна вага основного зразка на максимальному піку)
р
1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.6.1. Приготування стандартних розчинів полістиролу
Зразки полістиролу розчиняються методом обережного
помішування в обраному елюенті. Під час приготування розчинів
необхідно враховувати рекомендації виробника.
Показники концентрації обраних зразків залежать від різних
факторів, наприклад, об'єму нагнітання, в'язкості розчину та
чутливості аналітичного детектору. Максимальний об'єм нагнітання
повинен відповідати довжині колонки, щоб уникнути
перенавантаження. Типовими об'ємами нагнітання для аналітичних
розподілів, при застосуванні методу ГПХ з колонкою 30 см х 7,8 мм,
будуть показники 40-100 мю l. Допускаються вищі показники, але не
більше 250 мю l. Перед самим калібруванням колонки необхідно
визначити оптимальний показник співвідношення об'єму нагнітання та
концентрації.
1.6.2. Приготування зразка розчину
До приготування зразка розчину висуваються, в принципі, такі
самі вимоги. Зразок піддають розчиненню у відповідному розчиннику,
наприклад, тетрагідрофурані (ТГФ) методом обережного струшування.
За жодних умов не допускається, щоб розчинення проводилось у
ультразвуковій ванні. Якщо необхідно, то зразок розчину прочищають
мембранним фільтром з порами розміром 0,2-2 мю m.
Якщо присутні нерозчинені частинки, тоді під час остаточного
повідомлення результатів цей факт записують, оскільки поява таких
нерозчинених часток є результатом великої молекулярної маси. За
допомогою відповідного методу необхідно визначити, який відсоток
нерозчинених часток є присутній. Розчини необхідно використовувати
протягом 24 годин.
1.6.3. Прилад
- розчинний резервуар;
- дегазатор (якщо необхідно);
- насос;
- погашувач імпульсів/вібрацій (якщо необхідно);
- система впорскування/нагнітання;
- хроматографічна колонка;
- детектор,
- водомір (для вимірювання швидкості рідини в посудині) (якщо
необхідно),
- пристрій для записування даних,
- зливний резервуар.
Необхідно переконатись в тому, що система ГПХ є інертною по
відношенню до утилізованих розчинників (наприклад, застосувавши
металеві капілярні трубки для розчинника ТГФ).
1.6.4. Система впорскування та подачі розчинника
В колонку за допомогою автоматичного пробника або вручну
завантажують певний об'єм зразка розчину в призначену для цього
зону. У випадку, якщо користуються шприцом, непотрібно одразу
швидко послаблювати та відпускати плунжер шприца, оскільки це може
призвести до змін в ході подачі молекулярної маси. Система
впорскування та подачі розчинника повинна, якщо можливо, бути
такою, щоб там була відсутня вібрація (застосувавши погашувач
вібрацій). Швидкість руху речовини повинна становити 1 мл/хвилину.
1.6.5. Колонка
В залежності від зразка, полімер характеризується методом
застосування простої колонки або кількох, послідовно з'єднаних,
колонок. В наявності та вільному доступі повинні бути пористі
матеріали для колонки з визначеними властивостями (наприклад,
розміром пор, забороною щодо використання). Вибір розподільного
гелю та довжини колонки залежить, як від властивостей зразка
(гідродинамічні об'єми, розподілення молекулярної маси), так і від
особливих умов розподілу: розчинника, температури та швидкості
руху речовини (1)(2)(3).
1.6.6. Теоретичні тарілки
Колонка або комбінація колонок, що використовуються для
розподілу, повинні характеризуватись кількістю теоретичних
тарілок. У випадку з розчинником елюювання ТГФ сюди входить
завантаження колонки відомої довжини розчином етил бензолу чи
іншим відповідним аполярним розчином. Кількість теоретичних
тарілок визначається наступним рівнянням:
V V
e 2 e 2
N = 5,54 (-----) або N = 16 (---) W W
1/2
де
N = кількість теоретичних тарілок
V = об'єм елюювання при максимумі піку е
W = ширина піку на рівні нульової лінії
W = ширина піку на половині висоти 1/2
1.6.7. Ступінь очистки
В додаток до суми теоретичних тарілок, кількість яких
визначає ширину смуги пропускання, певну роль відіграє ступінь
очистки, що визначається кривизною калібрувальної кривої. Ступінь
очистки колонки вираховується наступною формулою:
V - V
e, M e, (10M )
x x куб.см ----------------------------------- >= 6,0 (------) cross sectional area of the collumn кв.см
область перехресного січення колонки,
де
V = об'єм елюювання полістиролу з молекулярною масою M е, Mx x
V = об'єм елюювання полістиролу з молекулярною е, (10.Mx) масою в десять разів більшою
Визначення системи виражається наступним чином:
V - V
e1 e2 1
R = 2 x --------- x -------------- 1,2 W + W log (M /M )
1 2 10 2 1
де
V , V = об'єми елюювання двох зразків полістиролу при e1 e2 максимумі піку
W , W = ширина піку на рівні нульової лінії 1 2
M , M = молекулярна вага при максимумі піку (має 1 2 відрізнятись фактором 10)
R - показник колонки має бути більший, ніж 1.7(4).
1.6.8. Розчинники
Всі розчинники повинні мати високий рівень очистки (високий
рівень очистки ТГФ повинен становити 99,5%). Резервуар з
розчинником повинен бути достатньо великим, щоб провести
калібрування колонки та декілька аналізів зразків. Розчинник має
бути дегазованим перед транспортуванням в колонку через насос.
1.6.9. Контроль за температурою
Температура критичних внутрішніх компонентів (петльовий
дозатор, колонки, детектор та трубна система) має бути сталою та
відповідати типу обраного розчинника.
1.6.10. Детектор
Завдання детектора полягає в тому, щоб записувати кількісну
концентрацію елюйованого в колонку зразка. Для того, щоб уникнути
зайвого розмивання піків, об'єм кюветки секції детектора повинен
бути якомога меншим. Він не має перевищувати 10 мю l, окрім
детекторів розсіювання світла та в'язкості. Для визначення, як
правило, використовується диференціальна рефрактометрія. Проте,
можуть застосовуватись інші типи детекторів, типу, УЧ детектор
в'язкості, ІЧ детектори в'язкості і т.д., якщо цього вимагають
певні особливості розчинника.
2. ДАНІ ТА ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
2.1. ДАНІ
Стандарт(1) HIC має стосуватись критеріїв детального
елюювання, а також і вимог щодо збору та обробки даних.
По кожному зразку проводять два окремих експерименти, які
необхідно аналізувати в індивідуальному порядку.
M , M , M /M та M повинні надаватись по кожному n w w n р вимірюванню. Необхідно чітко вказувати, що отримані розрахункові
показники є відносними показниками щодо молекулярної ваги взятого
зразка.
Після визначення об'ємів або часів утримання (за можливості
відкоригованих за допомогою внутрішнього зразка), логарифмічні
показники М (М максимуму піку калібрувального зразка) наносять
р р на графік стосовно одного з цих чисел. Необхідно, щоб було
щонайменше дві точки калібрування на групу з десяти молекулярних
мас, і п'ять точок вимірювання для загальної кривої, що має
охопити теоретично заплановану молекулярну масу зразка. Крайня
точка малої молекулярної маси калібрувальної кривої визначається
n-гексилбензолом або іншим відповідним аполярним розчином.
Середньочислові та середньовагові молекулярні маси, як правило,
визначаються методом електронного обрахунку даних, основаного на
формулах частини 1.2. якщо оцифровка робиться вручну, тоді в
якості посилання можна використати AABM D 3536-91 (3).
Крива розподілення подається, як таблиця або малюнок (частота
диференціалу чи сумарне відсоткове співвідношення відносно
логарифму М), графічно це виглядатиме так: група з десяти
молекулярних мас повинна мати 4 см товщини і максимум піку
становитиме близько 8 см висотою. Якщо йдеться про криві
інтегрального розподілення, тоді різниця ординат між 0 та 100% має
становити приблизно 10 см.
2.2. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ
Повідомлення результатів має включати наступну інформацію:
2.2.1. Тестована речовина:
- доступна інформація щодо точної специфікації речовини,
добавок, домішків,
- опис обробки зразка; спостереження, проблеми в ході
експерименту.
2.2.2. Прибори, апаратура:
- резервуар з елюентом, інертним газом, дегазація елюенту,
його склад, наявність домішок,
- насос, погашувач імпульсів, система нагнітання,
- колонки розподілення (виробник, вся інформація стосовно
характеристики колонок, наприклад, розмір пор, вид розподільного
матеріалу, тощо, кількість, довжина та порядок застосованих
колонок),
- кількість теоретичних тарілок колонки (або їх комбінація),
- інформація про всі екстраполяції, припущення та
співставлення, зроблені в ході проведення експерименту, оцінки та
обробки даних,
2.2.3. Всі замірювання, що використовувались при побудові
калібрувальної кривої, повинні бути задокументовані в таблиці, яка
включає наступну інформацію щодо кожного пункту калібрування:
- назва зразка,
- виробник зразка,
- характерні ознаки зразків M , M , M , M /M , інформація про
р n w w n які надається виробником або береться із замірів, отриманих
пізніше, разом з детальною інформацією щодо методу визначення,
- об'єм нагнітання/впорскування та концентрація,
- показник M , який застосовується при калібруванні,
р
- об'єм елюювання або відкоректований час утримання,
визначений на максимальній відмітці,
- показник M , який вираховується на максимальній відмітці,
р
- відносна помилка в % показника M та калібрувальної кривої.
р
2.2.4. Оцінювання
- оцінювання за шкалою часу: методи для перевірки
репродуктивності (метод коректування, внутрішній стандарт тощо),
- інформація стосовно того, чи оцінювання було проведено на
основі об'єму елюювання, чи часу утримання,
- інформація про обмеження оцінювання, якщо максимальна межа
не є достатньо проаналізованою,
- опис методів згладжування/вирівнювання, якщо такі
застосовувались,
- підготовка та методи попередньої обробки зразка,
- наявність нерозчинених часток, якщо такі є,
- об'єм нагнітання/впорскування (мю l) та його концентрація
(мг/мл),
- спостереження для виявлення факторів, які спричиняють
відхилення від ідеального профілю ГПХ,
- детальний опис усіх змін у ході процедур тестування,
- деталі щодо типів помилок,
- будь-яка додаткова інформація щодо інтерпретації
результатів.
3. ПОСИЛАННЯ
(1) DIN 55672(1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds., (1979)
Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley and Sons.
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for
Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by
Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation
Chromatography-GPC) American Society for Testing and Materials,
Philadelphia, Pennsylvania.
(4) ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test Method for Molecular
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene
by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American
Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Додаток

Приклади інших методів
визначення середньої молекулярної маси
(М ) полімерів
n

Гелепроникаюча хроматографія (ГПХ) є найкращим методом для
визначення М , особливо тоді, коли в наявності є набір стандартів
n (речовин, які добавляються в пробу для порівняльного вимірювання),
структура яких відповідає структурі полімеру. Проте, якщо
виникають практичні труднощі з використанням ГПХ або очікується,
що речовина не відповідатиме регуляторному критерію М (для чого
n
потрібно підтвердження), вдаються до наступних альтернативних
методів:
1. Використання колігативних властивостей
1.1. Ебуліоскопія/кріоскопія
включає оцінювання щодо визначення моменту закипання
(ебуліоскопія) або зниження температури/моменту замерзання
(кріоскопія) розчинника при додаванні в нього полімеру. Суть
методу полягає в тому, що дія розчиненого полімеру для визначення
моменту закипання/замерзання рідини залежить від молекулярної маси
полімеру (1)(2).
Придатність, М < 20000.
n
1.2. Зниження парового тиску
включає вимірювання зниження парового тиску певної базової
рідини до і після додавання визначеної кількості полімеру (1)(2).
Придатність, М < 20000 (теоретично; на практиці допускається
n будь-який обмежений показник).
1.3. Мембранна осмометрія
в основі лежить принцип осмосу, тобто, природна здатність
молекул розчинника проходити крізь напівпроникну мембрану
концентрованого розчину, щоб утворився баланс. Під час тестування
концентрація розчину буде нульовою, оскільки концентрований розчин
містить полімер. У результаті протягування розчинника крізь
мембрану отримаємо перепад тиску, який залежить від концентрації
та молекулярної маси полімеру (1)(3)(4).
Придатність, М між 20 000 - 200 000.
n
1.4. Осмометрія парової фази
полягає в порівнянні швидкості випаровування чистого
розчиненого аерозолю та його перетворенні на, щонайменше, три
аерозолі, які містять полімер різних концентрацій (1)(2)(4).
Придатність, М < 20 000.
n
2. Аналіз кінцевої групи
Для впровадження цього методу необхідно знати, як загальну
структуру полімеру, так і принцип розриву ланцюга кінцевих груп
(що мають бути відокремлені від основного скелету методом,
наприклад, ядерного магнітного резонансу (ЯМР) або
титруванням/дериватизацією). Визначення наявної в полімері
молекулярної концентрації кінцевих груп впливає на визначення
молекулярної маси (7)(8)(9).
Придатність, М до 50 000 (зі зниженням надійності).
n
3. Посилання
(1) Billmeyer, F.W.Jr., (1984) Textbook of Polymer Science,
3rd Edn., John Wiley, New York.
(2) Glover, C.A., (1975) Absolute Colligative Property
Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E.
Slade, Jr.ed., Marcel Dekker, New York.
(3) ASTM D 3750-79, (1979) Standard Practice for
Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by
Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials,
Philadelphia, Pennsylvania.
(4) Coll, H. (1989) Membrane Osmometry. In: Determination of
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52.
(5) ASTM 3592-77, (1977) Standard Recommended Practice for
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American
Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(6) Morris, C.E.M., (1989) Vapour Pressure Osmometry. In:
Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley
and Sons.
(7) Schroder, E., Muller, G., and Arndt, K-F., (1989) Polymer
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.
(8) Garmon, R.G., (1975) End-Group Determinations, Chapter 3
In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed., Marcel
Dekker, New York.
(9) Amiya, S., et al. (1990) Pure and Applied Chemistry, 62,
2139-2146.
А.19. СКЛАД НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНИХ ПОЛІМЕРІВ
1. МЕТОД
Метод гелепроникаючої хроматографії дублює ТІ (Тестові
інструкції) ОЕСР (Організації економічного співробітництва та
розвитку) 119 (1996). Основні принципи та подальша технічна
інформація подаються в посиланнях.
1.1. ВСТУП
Враховуючи те, що властивості полімерів досить різноманітні,
неможливо описати один єдиний метод, який би визначав умови для
розподілу та оцінки, що розповсюджуються на всі можливі
особливості й специфіку розподілення полімерів. Особливо це
стосується систем складних полімерів, які не піддаються методу
гельпроникаючої хроматографії (ГПХ). Таким чином, коли не вдається
використати метод ГПХ, молекулярну масу можна визначити за
допомогою інших методів (див. Додаток). У таких випадках необхідно
надати повну інформацію щодо деталей і доцільності методу, що
застосовується.
Описаний метод базується на Стандарті HIC 55672(1). Детальну
інформацію щодо того, як проводити експерименти та оцінювати дані,
можна знайти в цьому ж Стандарті HIC. Якщо необхідно змінити умови
експериментів, подається інформацію щодо доцільності таких змін.
Також, можна застосовувати інші стандарти, якщо на них є
відповідні посилання. У описаному методі для калібрування
використовуються зразки полістиролу певної полідисперсності. У
методі можливі зміни, якщо це необхідно для певних полімерів,
наприклад, у випадку з водорозчинними та довголанцюговими
полімерами.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ
Низька молекулярна маса М довільно визначається як
n молекулярна маса нижче 1000 дальтон.
Середня молекулярна маса М та середня молекулярна маса М
n w
визначаються наступними рівняннями:
n n
S H S H x M
i=1 i i=1 i i
M = ---------- M = --------------- n n w n
S H /M S H
i=1 i i i=1 i
де
S - знак суми,
Н - рівень сигналу детектора від нульового рівня для об'єму i утримування V ,
i
M - молекулярна маса частки полімеру при об'ємі утримування i V та n - кількість введення даних.
i
Ширина розподілення молекулярної маси, що є показником
дисперсності системи, задається у співвідношенні М /М .
w n
1.3. БАЗОВІ СУМІШІ
Оскільки метод ГПХ є досить відносним, необхідно проводити
калібрування. Для цього, як правило, використовують зразки
полістиролу лінійної конструкції й певної середньої молекулярної
маси М та М та розподільної маси. Калібрувальна крива
n w застосовується лише для визначення молекулярної маси невідомого
зразка, якщо умови розподілу пробних та основних зразків
визначались індивідуально.
Визначений взаємозв'язок між молекулярною масою та об'ємом
елюювання допускається лише за певних умов у окремому
експерименті. Перш за все, такі умови включають температуру,
розчинник (або розчинну суміш), хроматографічні умови й колонку
розподілу або систему колонок.
Таким чином, показники молекулярної маси визначеного зразка -
це лише відносні показники, які характеризуються як "відносні
показники молекулярної маси полістиролу". Це означає, що, залежно
від тих структурно-хімічних відмінностей, які існують між пробними
та основними зразками й стандартом, показники молекулярної маси
можуть дещо відхилятись від абсолютних показників. Якщо
використовуються інші стандарти, наприклад, поліетиленгліколь,
поліетилен оксид, поліметилметакрилат, поліакрилова кислота,
необхідно обумовити доцільність їх використання.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
За допомогою методу ГПХ можна визначити, як розподілення
молекулярної маси зразка, так і показники середньої молекулярної
маси (М та М ). Метод ГПХ - це особливий вид рідинної
n w хроматографії, у якому зразок розподіляють відповідно до
гідродинамічного об'єму окремих компонентів (2).
Розподіл відбувається тоді, коли зразок проходить крізь
колону, заповнену пористим матеріалом, як правило, органічним
гелем. Молекули малих розмірів проходять крізь пори, на відміну
від великих, які затримуються. Таким чином, ланцюг з великих
молекул є коротшим, і вони елююються першими. Молекули середніх
розмірів проходять крізь деякі пори та елююються пізніше. Найменші
молекули, гідродинамічний радіус яких менший за розмір гелевих
пор, можуть пройти крізь усі пори. Такі молекули елююються
останніми.
В ідеальному варіанті повинно бути так, щоб розподіл
молекулярних часток повністю залежав від їхнього розміру, але на
практиці досить важко уникнути хоча б кількох ефектів поглинання.
Погіршити ситуацію можуть нерівно запакована колонка та мертвий
простір (2).
Виявити поглинання можна за допомогою, наприклад, індексу
рефракції або ультрафіолетового випромінювання. Результати
відображаються на звичайній кривій розподілу. Проте, для того, щоб
на цій кривій відобразити фактичні показники молекулярної маси,
необхідно відкалібрувати колонку на прикладі полімерів визначеної
молекулярної маси і, в ідеальному варіанті, майже подібної
структури, наприклад, різних зразків полістиролу. Типово, що
йдеться про результати на кривій Гауса, які мають відхилення через
невелику криву розподілення в бік низької молекулярної ваги;
вертикальна вісь показує кількість різних молекулярних елюючих
часток на певну одиницю ваги, а горизонтальна - логарифмічну
молекулярну вагу.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Повторюваність (Відносне стандартне відхилення: ВСВ) об'єму
елюювання повинна бути більшою за 0,3%. Необхідно перевірити
повторюваність аналізу через внутрішній стандарт, якщо оцінка
хроматограми залежить від часу та не відповідає вищезгаданому
критерію (1). Полідисперсність залежить від молекулярної ваги
зразків. Типовими показниками для стандартних зразків полістиролу
є такі:
M < 2 000 M /M < 1,20
p w n
6
2 000 <= M <= 10 M /M < 1,05
p w n
6
M > 10 M /M < 1,20
p w n
(М -молекулярна вага основного зразка на максимальній
p
відмітці)
1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.6.1. Приготування стандартних розчинів полістиролу
Зразки полістиролу розчиняються методом обережного
помішування в обраному елюенті. Під час приготування розчинів
необхідно враховувати рекомендації виробника.
Показники концентрації вибраних зразків залежать від різних
факторів, наприклад, від об'єму нагнітання/впорскування, в'язкості
розчину та чутливості аналітичного детектору. Максимальний об'єм
нагнітання повинен відповідати довжині колонки, щоб уникнути
перенавантаження. Типовими об'ємами нагнітання для аналітичних
розподілів, при застосуванні методу ГПХ з колонкою 30 см х 7,8 мм,
будуть показники 40-100 мю l. Допускаються вищі показники, але не
більше за 250 мю l. Перед самим калібруванням колонки потрібно
визначити оптимальний показник співвідношення об'єму нагнітання та
концентрації.
1.6.2. Приготування зразка розчину
До приготування зразка розчинів висуваються, загалом, ті ж
самі вимоги. Зразок піддають розчиненню у відповідному розчиннику,
наприклад, тетрагідрофурані (ТГФ) методом обережного струшування.
За жодних умов не допускається, щоб розчинення проводилось в
ультразвуковій ванні. За необхідності зразок розчину прочищають
мембранним фільтром з порами розміром 0,2-2 мю m.
Інформація про наявність нерозчинних часто має міститися в
остаточному звіті, оскільки їхня поява є результатом великої
молекулярної маси. За допомогою відповідного методу необхідно
визначити відсоток нерозчинених часток. Розчини необхідно
використовувати протягом 24 годин.
1.6.3. Коректування суміші: виявлення домішок та добавок
Як правило, необхідно проводити коректування складу груп
речовин M < 1 000 в суміші на предмет виявлення в ній особливих
неполімерних компонентів (наприклад, домішки та/чи добавки), але
лише за умов, коли вони складають < 1%. Це проводиться методом
прямого аналізу полімерного розчину або елюата ГПХ.
У тих випадках, коли елюат після проходження колонки є надто
розбавленим, подальший аналіз проводять із застосуванням вже
концентрованого елюату. Може виникнути необхідність випарувати
елюат до сухого стану й розчинити його знову. Концентрація елюата
досягається щоб шляхом уникнення змін в самому елюаті. Обробка
елюата після стадії ГПХ залежить від аналітичного методу, що
застосовується для кількісного аналізу.
1.6.4. Прилад
Прилад ГПХ складається з наступних компонентів:
- розчинний резервуар;
- дегазатор (якщо необхідно);
- насос;
- погашувач імпульсів/вібрацій (якщо необхідно);
- система впорскування/нагнітання;
- хроматографічна колонка;
- детектор,
- водомір (якщо необхідно),
- пристрій для записування даних,
- зливний резервуар.
Необхідно переконатись в тому, що система ГПХ є інертною
стосовно утилізованих розчинників (наприклад, застосувавши
металеві капілярні трубки для розчинника ТГФ).
1.6.5. Система впорскування та подачі розчинника
В колонку за допомогою автоматичного пробника або вручну
завантажують певний об'єм зразка розчину в призначену для цього
зону. У випадку, якщо користуються шприцом, непотрібно одразу
швидко послаблювати та відпускати плунжер шприца, оскільки це може
призвести до змін в ході подачі молекулярної маси. Система
впорскування та подачі розчинника повинна, якщо можливо, бути
такою, щоб там була відсутня вібрація (застосувавши погашувач
вібрацій). Швидкість руху речовини повинна становити 1 мл/хвилину.
1.6.6. Колонка
Залежно від зразка, полімер описують застосовуючи одну або
кілька простих колонок, з'єднаних послідовно. Наявними та у
вільному доступі повинні бути пористі матеріали для колонки з
визначеними властивостями (наприклад, розміром пор, спеціальними
обмеженнями). Вибір розподільного гелю та довжини колонки залежить
від властивостей зразка (гідродинамічні об'єми, розподілення
молекулярної маси) і від особливих умов розподілу: розчинника,
температури та швидкості руху речовини (1)(2)(3).
1.6.7. Теоретичні пластини
Колонка або комбінація колонок, що використовуються для
розподілу, повинні бути охарактеризованими теоретичними
пластинами. У випадку з розчинником елюювання ТГФ сюди входить
заповнення колонки певної довжини розчином етил бензолу чи іншим
відповідним аполярним розчином. Кількість теоретичних пластин
визначається наступним рівнянням:
V V
e 2 e 2
N = 5,54 (-----) або N = 16 (---) W W
1/2
де
N = кількість теоретичних пластин
V = об'єм елюювання при максимальній відмітці е
W = ширина меж на нульовій відмітці
W = ширина меж на половині висоти 1/2
1.6.8. Ступінь очистки
У додаток до суми теоретичних пластин, кількість яких
визначає ширину смуги пропускання, певну роль відіграє ступінь
очистки, що визначається кривизною калібрувальної кривої. Ступінь
очистки колонки вираховується за наступною формулою:
V - V
e, M e, (10M )
x x куб.см ------------------------------------ >= 6,0 (------) область перехресного січення колонки кв.см
де
V = об'єм елюювання полістиролу з молекулярною масою M е, Mx х
V = об'єм елюювання полістиролу з молекулярною е, (10.Mx) масою, більшою в десять разів
Визначення системи визначається наступним чином:
V - V
e1 e2 1
R = 2 x --------- x -------------- 1,2 W + W log (M /M )
1 2 10 2 1
де
V , V = об'єми елюювання двох зразків полістиролу на e1 e2 максимальній відмітці
W , W = ширина меж на нульовій відмітці 1 2
M , M = молекулярна вага при максимумі піку (повинна 1 2 відрізнятись фактором 10)
R - показник колонки повинен бути більший, ніж 1.7(4).
1.6.9. Розчинники
Усі розчинники повинні мати високий рівень очистки (високий
рівень очистки ТГФ повинен становити 99,5%). Резервуар з
розчинником повинен бути достатньо великим, щоб провести
калібрування колонки та декілька аналізів зразків. Розчинник
повинен бути дегазованим в колонку через насос перед
транспортуванням.
1.6.10. Контроль температури
Температура критичних внутрішніх компонентів (петлевий
дозатор, колонки, детектор та система труб) повинна бути сталою й
відповідати типу обраного розчинника.
1.6.11. Детектор
Завдання детектора полягає в тому, щоб записувати кількісну
концентрацію елюйованого в колонку зразка. Для того, щоб уникнути
зайвого розмивання меж, об'єм кюветки секції детектора повинен
бути якомога меншим.
Він не повинен перевищувати 10 мкл, окрім детекторів
розсіювання світла та в'язкості. Для визначення, як правило,
використовується диференціальна рефрактометрія. Проте, можуть
застосовуватись інші типи детекторів, типу, УЧ детектор в'язкості,
ІЧ детектори в'язкості й т.д., якщо цього вимагають особливості
розчинника.
2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ
2.1. ДАНІ
Стандарт (1) HIC стосується критеріїв детального елюювання, а
також вимог щодо збору та обробки даних.
З кожним зразком проводять два окремих експерименти, які
необхідно аналізувати в індивідуальному порядку. В усіх випадках
необхідно також надавати дані з холостих проб, які обробляються
так само, як і зразок.
Необхідно чітко вказувати, що отримані розрахункові показники
є відносними показниками щодо молекулярної ваги взятого зразка.
Після визначення об'ємів або часу утримання (за можливості
відкоректованих за допомогою внутрішнього зразка), логарифмічні
показники М (М максимальної межі калібрувального зразка) вносять
р р в графік відносно відповідно до їх кількості. Необхідно, щоб було
щонайменше дві відмітки про калібрування на групу з десяти молекул
і п'ять вимірювань для загальної кривої, що має охопити теоретично
заплановану молекулярну масу зразка. Крайня відмітка низької
молекулярної маси калібрувальної кривої визначається
n-гексилбензолом або іншим відповідним аполярним розчином.
Середньокількісні та середньовагові молекулярні маси, як правило,
визначаються методом електронного обрахунку даних, що базується на
формулах пункту 1.2. Якщо обрахунки робляться вручну, в якості
посилання можна використовувати AABM D 3536-91 (3).
Якщо який-небудь з нерозчинних полімерів затримується в
колонці, очевидно,що його молекулярна маса буде більшою, ніж маса
розчинної частки. Тож, якщо не звернути на це уваги, такий факт
може призвести до переоцінки визначення малої молекулярної маси.
Інформація щодо коректування малої молекулярної маси нерозчинених
полімерів представлена в Додатку.
Крива розподілення подається у вигляді таблиці або малюнку
(частота диференціалу чи сумарне процентне співвідношення відносно
логарифму М). Графічно це виглядатиме так: група з десяти
молекулярних мас повинна бути 4 см завтовшки, і максимальна
відмітка становитиме близько 8 см у висоту. Якщо йдеться про криві
інтегрального розподілення, різниця ординат між 0 та 100% повинна
становити приблизно 10 см.
2.2. ЗВІТНІСТЬ
Звітність повинна містити наступну інформацію:
2.2.1. Тестована речовина:
- доступна інформація щодо точної специфікації речовини,
добавок, домішок,
- опис обробки зразка; спостереження, проблем, що виникли в
ході експерименту.
2.2.2. Прибори, апаратура:
- резервуар з елюентом, інертним газом, дегазація елюенту,
його склад, наявність домішок,
- насос, погашувач імпульсів, система нагнітання,
- колонки розподілення (виробник, вся інформація стосовно
характеристики колонок, наприклад, розмір пор, вид розподільного
матеріалу тощо, кількість, тривалість і порядок застосованих
колонок),
- кількість теоретичних тарілок колонки (або їх комбінація),
ступінь очистки (розрізнення системи),
- інформація щодо симетрії меж,
- температура колонки, вид температурного контролю,
- детектор (принцип вимірювання, тип, об'єм кюветки),
- водомір, якщо такий використовується (виробник, принцип
вимірювання),
- система запису та обробки даних (апаратура й комп'ютерне
програмне забезпечення).
2.2.3. Калібрування системи
- детальний опис методу, що застосовується для побудови
калібрувальної кривої,
- інформація про критерій якісної оцінки методу (наприклад,
кореляційний коефіцієнт, остаточна сума квадратів тощо),
- інформація про всі екстраполяції, припущення та
співставлення, зроблені в ході проведення експерименту, оцінки та
обробки даних,
- всі замірювання, що використовувались при побудові
калібрувальної кривої, повинні бути задокументовані в таблиці, яка
включає наступну інформацію про кожний пункт калібрування:
- назва зразка,
- виробник зразка,
- характерні ознаки зразків M , M , M , M /M , інформація про
p n w w n які надається виробником або береться з пізніше проведених
замірювань, разом з детальною інформацією щодо методу визначення,
- об'єм нагнітання/впорскування та концентрація,
- показник M , який застосовується при калібруванні,
p
- об'єм елюювання або відкоректований час утримання,
визначений на максимальній відмітці,
- показник M , який вираховується на максимальній відмітці,
p
- відносна помилка показника M та калібрувальної кривої у %.
p
2.2.4. Інформація про низьку молекулярну масу полімеру:
- опис методів аналізу та спосіб проведення експериментів,
- інформація про відсоток низької молекулярної маси часток
речовини (w/w) порівняно з цілим зразком,
- інформація у відсотках про наявність домішок, добавок та
неполімерних часток порівняно з вагою цілого зразка,
2.2.5. Оцінювання
- оцінювання за часовою шкалою: методи для перевірки
репродуктивності (метод коректування, внутрішній стандарт тощо),
- інформація стосовно того, чи оцінювання було проведено на
основі об'єму елюювання, чи тривалості утримання,
- інформація про обмеження оцінювання, якщо межа не є
повністю проаналізованою,
- опис методів згладжування/вирівнювання, якщо такі
застосовувались,
- підготовка та методи попередньої обробки зразка,
- наявність нерозчинних часток, якщо такі є,
- об'єм нагнітання/впорскування (мкл) та його концентрація
(мг/мл),
- спостереження для виявленню факторів, що призводять до
відхилень від ідеального профілю ГПХ,
- детальний опис усіх змін під час процедур тестування,
- деталі щодо інтервалів помилок,
- будь-яка додаткова інформація щодо інтерпретації
результатів.
3. ПОСИЛАННЯ
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979)
Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
(3) ASTM D 3536-91, (1991) Standard Test method for Molecular
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC).
American Society for Testing and Materials, Philadelphia,
Pennsylvania.
(4) ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test method for Molecular
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene
by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American
Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Додаток

Рекомендації щодо корекції низької молекулярної маси
для виявлення нерозчинного полімеру

Якщо в зразку є нерозчинений полімер, це призводить до втрати
маси під час проведення аналізу ГПХ. Нерозчинений полімер в
будь-якому випадку утримуватиметься колонкою або фільтром як під
час проходження розчинної частини зразка крізь колонку. У випадку,
якщо вдається вирахувати коефіцієнт збільшення показника
заломлення (dn/dc) полімеру, можна оцінити втрату маси зразка в
колонці. Таким чином, корекція проводиться завдяки зовнішньому
калібруванню із застосуванням стандартних матеріалів певної
концентрації та dn/dc для того, щоб відкалібрувати показники
рефрактометра. У подальших прикладах використовується стандарт
полі(метилметакрилату) (ПММК).
При зовнішньому калібруванні акрилових полімерів, стандарту
ПММК певної концентрації в тетрагідрофурані, використовується ГПХ
аналіз, а отримані дані використовують для встановлення константи
рефрактометра, як показано в даному рівнянні:
K = R/(C x V x dn/dc)
де:
K = константа рефрактометра (у мікровольт секундах/мл),
R = показник зразка-стандарту ПММК (в мікровольт/секунду),
C = концентрація зразка-стандарту ПММК (в мг/мл),
V = об'єм нагнітання/впорскування (в мл) та
dn/dc = інкремент показника заломлення ПММК у
тетрагідрофурані (в мл/мг).
Для зразка-стандарту ПММК типовими є такі показники:
R = 2 937 891
C = 1,07 мг/мл
V = 0,1 мл
-5
dn/dc = 9 x 10 мл/мг
11
вихідний показник К, 3,05 х 10 потім використовують для
вираховування теоретичного показника детектора, якщо 100%
введеного полімеру пройшло елюювання детектором.
А.20. ОСОБЛИВОСТІ ПОВЕДІНКИ ПОЛІМЕРУ В ВОДІ
ПРИ РОЗЧИНЕННІ/ВИОКРЕМЛЕННІ
1. МЕТОД
Метод гельпроникаючої хроматографії є повторенням ТІ
(Тестових інструкцій) ОЕСР (Організація економічного
співробітництва та розвитку) 120 (1997). Основні принципи та
подальша технічна інформація подається в посиланні(1).
1.1. ВСТУП
Для деяких полімерів, наприклад, емульсійних, необхідно
провести попередню обробку перед застосуванням нижчеописаного
методу. Такий метод не застосовується до рідких полімерів, які
реагують з водою за умов тестування.
У випадку, якщо метод не практичний або його неможливо
використати, поведінку полімеру в воді при розчиненні та
виокремленні можна дослідити іншими способами. Тоді необхідно
надати повну детальну інформацію щодо необхідності та доцільності
застосування обраного методу.
1.2. НЕОБХІДНІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Поведінка полімеру при розчиненні та виокремленні у водному
середовищі визначається за допомогою методу колби (див.
Водорозчинність, Метод розділення рідини за допомогою колби) та
нижчеописаних модифікацій.
1.4. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Відсутні.
1.5. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.5.1. Обладнання
Для використання методу необхідно наступне обладнання:
- пристрій для подрібнення, наприклад, млинок для подрібнення
частинок певного розміру,
- прилад для струшування з можливістю контролю температури,
- система з мембранним фільтром,
- відповідна аналітична апаратура,
- звичайне сито.
1.5.2. Приготування зразка
Представлений для тестування зразок необхідно спочатку
подрібнити до розміру частинок 0,125 та 0,25 мм, використовуючи
для цього відповідне сито. Для стабільності/стійкості зразка або
для процесу подрібнення може бути необхідним вихоловання речовини.
Гумові та каучукоподібні матеріали можна подрібнювати при
температурі рідкого азоту (1).
Якщо ж неможливо отримати частинки потрібного розміру,
необхідно докласти зусиль, щоб подрібнити зразок на якомога менші
шматки й повідомити про отримані результати. У доповіді потрібно
вказати умови збереження подрібненого зразка перед тестуванням.
1.5.3. Процедура
Три зразки тестованої речовини вагою 10 г зважуються в кожній
з трьох посудин зі скляними пробками, і в кожну з них додається по
1000 мл води. Якщо використання 10 г полімеру виявиться
неможливим, необхідно застосувати іншу максимально доступну
кількість речовини, додавши при цьому необхідну кількість води.
Посудини закривають скляними пробками, а потім збовтують при
температурі 20 град.С. Для цього необхідно застосовувати
відповідний апарат для струшування/збовтування, що працює при
сталій температурі. Після 24 годин вміст кожної посудини
переміщують у центрифугу або фільтрують, а концентрацію полімеру в
чистій водній фазі визначають відповідним аналітичним методом.
Якщо ж таких методів немає, тоді загальну розчинність/виділення
можна визначити із сухої маси того, що залишилось на фільтрі або з
осаду в центрифузі.
З одного боку, необхідно, як правило, зробити кількісний
аналіз домішок та добавок, а з іншого - визначити низьку
молекулярну масу часток. Також важливо, проводити пусту пробу без
тестованої речовини, для виявлення залишків, які утворюються в
результаті експерименту.
Поведінка полімерів у водному середовищі під час
розчинення/екстракції при 37 град.С, рН 2 і рН 9 може визначатись
так само, як і в описаному експерименті при 20 град.С. Показників
рН можна досягнути методом додавання відповідних розчинів основ
або кислот, таких як соляна кислота, оцтова кислота, гідроксид
натрію чи калію відповідного ступеня, або NH .
3
Залежно від того, який метод аналізу застосовувався,
необхідно провести 1-2 тести. Одного вищеописаного тесту буде
достатньо за доступності достатньо специфічних методів прямого
аналізу водної фази на вміст полімеру. Проте, якщо таких методів
немає й визначення розчинності/виокремлення полімеру зводиться до
непрямого аналізу, визначаючи таким чином лише загальний вміст
органічного вуглецю (ЗВОВ) у водному екстракті, тоді необхідно
провести додатковий тест. Цей додатковий тест також проводиться
тричі/в три етапи, використовуючи в десять разів менші полімерні
зразки й таку саму кількість води, як в першому тесті.
1.5.4. Аналіз
1.5.4.1. Проведення тесту зі зразком одного розміру
Методи підходять для прямого аналізу компонентів полімеру у
водній фазі. У якості альтернативи можна розглядати непрямий
аналіз розчинених/добутих компонентів полімеру, визначаючи при
цьому вміст розчинених часток та корегуючи речовину на наявність у
ній неполімерних складників.
Аналіз водної фази для визначення загальної кількості
полімерних часток можливий у випадку використання одного з
достатньо чутливих методів, а саме:
- ЗВОВ, з використанням персульфату або розщепленого
дихромату для отримання СО , а також подальшою оцінкою за
2 допомогою методу ІЧ або за допомогою хімічного аналізу,
- атомна абсорбційна спектрометрія (ААС) чи еквівалентні
методи Виділення плазми з індуктивним зв'язком (ПІЗ) - для
полімерів з вмістом силікону чи металу,
- УФ абсорбція або спектрофлуорометрія - для арильних
полімерів,
- LC-MS для зразків з низькою молекулярною масою,
або методом вакуумного випаровування до сухого стану водного
екстракту та спектроскопічним (ІЧ, УЧ, тощо) аналізом
залишків/осаду, а також методом ААС/ПІЗ.
Якщо аналіз водної фази, як такої, неможливий, водний
екстракт необхідно виділити за допомогою органічного розчинника,
що не змішується з водою, наприклад, хлорованого вуглеводню. Потім
розчинник випаровується, а осад аналізують відповідно до описаного
методу аналізу складу полімерів. Якщо буде виявлено певні
компоненти, що класифікуються, як домішки або добавки, необхідно
їх усунути, щоб визначити рівень розчинності/виокремлення самого
полімеру.
Якщо виокремлюють досить велику кількість такого матеріалу,
може виявитись необхідним піддати виявлені залишки/осад аналізу
РХВТ (Рідинна хроматографія високого тиску) або ГХ (газова
хроматографія), щоб відрізнити домішки з мономеру та виведених з
мономеру часток. Це необхідно для того, щоб визначити точний склад
останнього.
У деяких випадках достатньо провести випаровування
органічного розчинника, довести його до сухого стану та зважити
сухий осад/залишок.
1.5.4.2. Проведення тесту двох зразків різних розмірів
Усі водні екстракти аналізують для виявлення ЗВОВ.
Проводять зважування нерозчиненої/невиокремленої частини
зразка. Якщо після обробки в центрифузі або фільтрації вмісту
кожної посудини буде виявлено, що залишки/осад полімеру
залишаються на стінках, тоді посудину необхідно сполоснути
фільтратом до повного очищення від видимого осаду. Після цього
фільтрат знову віддають в центрифугу або фільтрують. Залишки, що
залишаються на фільтрі або трубці центрифуги, висушують при
40 град.С, у вакуумі та зважують. Висушування необхідно
продовжувати до отримання сталої ваги.
2. ДАНІ
2.1. ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ ЗІ ЗРАЗКОМ ОДНОГО РОЗМІРУ
Необхідно подати результати дослідження зразків кожної з
трьох колб окремо, а також середні показники, які виражаються в
одиницях маси на об'єм розчину (як правило, мг/л) або маси на масу
зразка полімеру (як правило, мг/г). Крім того, необхідно
зафіксувати показник втрати ваги зразка (вираховується так: вага
розчину ділиться на вагу початкового зразка). Відносні стандартні
відхилення (ВСВ) також необхідно вираховувати. Індивідуальні
показники також вираховуються для цілої речовини
(полімер + необхідні добавки тощо), а також окремо для полімеру
(наприклад, після виокремлення пропорційної частки з таких
добавок).
2.2. ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ З ДВОМА ЗРАЗКАМИ РІЗНИХ РОЗМІРІВ
Необхідно подати показники водного екстракту для виявлення
ЗВОВ кожної з трьох колб окремо, а також середні показники кожного
експерименту, які виражаються в одиницях маси на об'єм розчину (як
правило, мг/л) або маси на масу початкового зразка полімеру (як
правило, мгС/г).
Якщо показники великої й малої порції води не відрізняються,
це може говорити про те, що всі екстраговані компоненти дійсно
виокремилися. Тоді прямого аналізу проводити непотрібно.
Окрему вагу залишку/осадку не потрібно подавати й виражати у
відсотковому співвідношенні з початковою вагою. У кожному
експерименті потрібно вираховувати середні показники. Різниця між
100 та виявленим відсотковим співвідношенням вказує на
співвідношення розчиненого та виокремленого матеріалу у вихідному
зразку.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО ТЕСТУВАННЯ
Звітність про тестування повинна містити наступну інформацію:
3.1.1. Тестована речовина:
- доступна інформація про саму речовину (характерні
особливості, домішки, добавки, вміст часток низької молекулярної
маси).
3.1.2. Умови експерименту:
- опис застосованих методів та умов проведення експерименту,
- опис аналітичного методу та методу виявлення.
3.1.3. Результати:
- результати розчинення/виокремлення в мг/л; індивідуальні та
середні показники тестів виокремлення, проведених з використанням
різних розчинів для виявлення вмісту полімеру та домішок, добавок
тощо,
- результати розчинності/виокремлення полімеру в мг/г,
- показники ЗВОВ у водних екстрактах, вага розчину та
обчислені співвідношення, якщо такі вимірювання проводились,
- рН кожного зразка,
- інформація про показники холостих випробувань,
- посилання на хімічну нестійкість тестованої речовини, як
під час самого тестування, так і процесу аналізу, за необхідності,
- будь-яка інформація щодо інтерпретації результатів.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen
fur Prufzwecke.
А.21. ОКИСЛЮВАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ РІДИН
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Метод полягає у вимірюванні здатності рідини збільшувати
швидкість чи інтенсивність горіння легкозаймистої речовини, або
утворювати суміш із легкозаймистою речовиною, що спонтанно
спалахує під час змішування. За основу в даному методі
використовується затверджений UN тест для окислювальних рідин(1),
якому даний метод є еквівалентним . Проте, оскільки цей метод А.21
головним чином розроблений для того, щоб відповідати вимогам
Положення ЄС N 1907/2006, вимагається порівняння лише з однією
базовою речовиною. Тестування й порівняння з іншими додатковими
базовими речовинами може бути необхідним тоді, коли очікується, що
результати тестування використовуватимуться для інших потреб(1).
---------------- (1) Як, наприклад, у документі про правила транспортування
UN.
Непотрібно проводити тестування, якщо дослідження структурної
формули показують, без жодних підстав для сумнівів, що речовина
дає екзотермічну реакцію з легкозаймистим матеріалом.
Важливо мати попередню інформацію щодо можливої
вибухонебезпечності речовини перед проведенням самого тесту.
Тестування не застосовується до твердих речовин, газів,
вибухонебезпечних або сильно вибухонебезпечних речовин та до
органічного перекису водню.
Немає потреби проводити тестування, якщо є результати
тестованої речовини з UN тестування для окислювальних рідин (1).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
Середній час зростання тиску - це середній з вимірюваних
показників часу показник тестованої суміші, за який тиск зростає
від 690 кПа до 2 070 кПа вище атмосферного тиску.
1.3. БАЗОВА РЕЧОВИНА
65% (w/w) водно-азотна кислота (чистого реактиву)
використовується в якості базової речовини (2).
---------------- (2) Кислоту потрібно титрувати перед тестуванням, щоб
підтвердити її концентрацію.
Якщо остаточні результати тестування можуть бути використані
з іншими цілями(1), варто провести тестування додаткових базових
речовин(3).
---------------- (3) Наприклад, 50% (w/w) хлорної кислоти та 40% (w/w)
натрієвої солі використовуються в посиланні 1.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Тестовану рідину змішують у пропорції один до одного, згідно
маси, з волокнистою целюлозою та переміщують у герметичний посуд.
Непотрібно продовжувати експеримент, якщо під час змішування або
наповнення посуду суміш спалахує.
Якщо ж суміш не спалахує, проводять повний тест. Суміш в
герметичній посудині нагрівають та визначають середній показник
часу зростання тиску від 690 кПа до 2 070 кПа вище атмосферного
тиску. Отриманий показник порівнюють із середнім показником часу
зростання тиску суміші базової речовини (речовин), змішаної в
пропорції 1:1 з целюлозою.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Отримані у ході проведення серії тестувань з п'яти спроб на
прикладі однієї базової суміші результати не повинні відрізнятись
від арифметичного середнього показника більше, ніж на 30%.
Результати, що відрізняються більше, ніж на 30% від середнього
показника, не повинні братись до уваги, і, відповідно, необхідно
вдосконалити процес змішування та заповнення посуду складовими, а
сам тест провести знову.
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Підготовка
1.6.1.1. Займиста речовина
В якості займистої речовини використовують висушену
волокнисту целюлозу з довжиною волокон 50-250 мю m та середнім
діаметром 25 мю m(1). Целюлозу висушують до сталої ваги,
викладаючи пластами завтовшки 25 мм при 105 град.С на чотири
години й тримають у вологопоглинаючій печі до охолодження й
придатності до використання. Вміст води у висушеній целюлозі не
повинен перевищувати 0,5% сухої маси(2). При необхідності час
висушування можна продовжити, щоб отримати бажаний результат(3).
Той самий вид целюлози має використовуватися під час проведення
усіх тестів.
---------------- (1) Наприклад, Целюлозний порошок хроматографічної колони
ватману CF 11, каталог N 4021 050.
(2) Підтвердження титруванням методом Карла Фішера.
(3) Як альтернатива, такого ж вмісту води можна досягнути,
наприклад, нагріванням при температурі 105 град.C в умовах вакууму
протягом 24 годин.
1.6.1.2. Прилади
1.6.1.2.1. Герметичний посуд
Для проведення тестування необхідно застосовувати герметичний
посуд, який складається з металевого герметичного резервуару
циліндричної форми завдовжки 89 мм та зовнішнім діаметром 60 мм
(див. малюнок 1). Для того, щоб полегшити тримання посуду під час
кріплення пожежного та вентиляційного кранів, необхідно обробити
на станку дві плоских грані (зменшуючи поперечний розріз посуду до
50 мм). Посуд, який має отвір діаметром 20 мм повинен мати з
будь-якого боку внутрішній паз глибиною 19 мм та різьбу для того,
щоб туди міг зайти однодюймовий гвинт Британської конічної різьби
для труб (БТКР) або його метричний еквівалент. До викривленої
грані герметичного посуду, на відстані 35 мм з одного кінця та
90 градусів від оброблених граней, прикручується боковий важіль
подачі тиску. Щоб прикрутити важіль потрібно зробити заглиблення
на 12 мм та нарізати з одного боку різьбу для гвинта 1/2 дюйми
БТКР (або еквівалент в метричних одиницях). Якщо необхідно, тоді
прикріплюють інертний ущільнювач або замазку, щоб уникнути виходу
газу. Боковий важіль з отвором 6 мм має продовжується на 55 мм
нижче корпусу герметичного посуду. На одному кінці важеля робиться
паз та нарізується різьба для датчика тиску мембранного типу.
Можна використовувати будь-який пристрій для вимірювання тиску,
але за умови, що він не піддається впливу гарячих газів/парів або
продуктів розпаду та витримує швидкість збільшення тиску від
690 до 2070 кПа, а його довжина становить не більше 5 метрів.
Кінець герметичного посуду з довшої від важеля сторони
закривається протипожежною пробкою, до якого кріпляться два
електроди, один з яких ізолюється, а інший заземлюється до корпусу
пробки. До іншого кінця посуду кріплять запобіжну мембрану
(витримує тиск, приблизно, 2200 кПа), яка фіксується заглушкою з
20-тиміліметровим отвором. Якщо необхідно, тоді до протипожежної
пробки прикріплюють інертний ущільнювач або замазку, щоб уникнути
виходу газу. Для закріплення пристрою в правильному положенні під
час тесту використовують підставку (див. малюнок 2). Така
підставка повинна мати основу з м'якої сталі та розміри:
235 мм x 184 мм x 6 мм та 185 мм довжини квадратного пустотілого
профілю (КПП) 70 мм x 70 мм x 4 мм.
Профіль ріжуть із кожної з двох протилежних сторін одного
кінця довжини КПП так, щоб профіль на двох плоских опорах був на
86 мм вищий за розміри профілю інтактної коробки. Кінці цих
плоских опор вирізають під кутом 60 град. до горизонталі та
приварюють до основи платформи. Прорізи розміром 22 мм завширшки
та 46 мм глибиною обробляють з одного верхнього кінця профілю так,
щоб коли герметичний посуд опускають у підставку, протипожежною
пробкою спочатку, боковий важіль заходив у проріз. Сталевий лист
завширшки 30 мм та завтовшки 6 мм приварюють до нижньої
внутрішньої частини профілю коробки в якості прокладки. Два
7-миміліметрові гвинти з рифленою головкою прикручують з іншого
боку, щоб герметичний посуд був міцно закріплена на місці. Знизу
приварюють дві сталеві смужки завширшки 12 мм та завтовшки 6 мм.
Їх приварюють до боків, що виступають за основу профілю коробки,
для підтримки посудини.
1.6.1.2.2. Система нагнітання/впорскування
Система нагнітання/впорскування складається з
25-тисантиметрового нікель-хромового дроту діаметром 0,6 мм та з
опором 3,85 ом/м. Це скручений витками дріт з діаметром витків
5 мм, що має форму котушки та кріпиться до електродів
протипожежної пробки. Котушка повинна відповідати конфігураціям,
як на мал. 3. Відстань між днищем герметичного посуду та низом
котушки запалювання повинна бути 20 мм. Якщо електроди не
регулюються, потрібно ізолювати керамічним покриттям провід
нагнітання та днище посуду. Дріт, який нагрівається постійною
напругою електроенергії, повинен видавати не менше 10 А.
1.6.2. Проведення тестування(4)
Повністю зібраний прилад з датчиком тиску та системою
нагріву, але без запобіжної мембрани, має знаходитись в положенні
із закритою протипожежною пробкою. 2,5 г рідини для тестування
змішують з 2,5 г сухої целюлози в склянці, помішуючи скляним
патичком(5). Задля безпеки перемішування необхідно проводити з
використанням захисного щитка між оператором і сумішшю. Якщо під
час змішування або заповнення суміш спалахує, подальше тестування
не проводиться.
---------------- (4) Необхідно особливо обережно ставитись до сумішей
окислювачів з целюлозою, як до потенційно вибухонебезпечних.
(5) На практиці цього можна досягти, приготувавши суміш 1:1 з
тестованої рідини та целюлози, більшої кількості, ніж потрібно для
тестування та передачі 5 +- 0,1 г в герметичний посуд. Для кожної
проби використовують лише свіжу суміш.
Суміш додають невеликими кількостями до герметичного посуду
так, щоб суміш заповнювала місце довкола котушки запалювання і
мала з нею хороший контакт. Дуже важливо, щоб котушка не змінювала
конфігурації, оскільки це може призвести до невірних
результатів(1). Запобіжну мембрану ставлять на відповідне місце, а
утримуючу пробку тісно затягують. Заповнений герметичний посуд
ставлять на підставку для запалювання. Запобіжна мембрана
знаходиться у верхньому положенні. Підставку поміщують в армовану
витяжну шафу або камеру горіння. Напруга подається на внутрішні
затискачі протипожежної пробки й дається розряд силою 10 А. Час
між початком змішування та включенням подачі напруги не повинен
перевищувати 10 хвилин.
---------------- (1) Зокрема, слід уникати контакту із розташованими поруч
витками котушки.
Датчик тиску дає сигнал, який відповідна система записує, що
дозволяє оцінити та сформувати запис сталого часу профілю тиску
(наприклад, самозаписуючий пристрій невстановлених процесів разом
з діаграмним записуючим пристроєм). Суміш нагрівають 60 секунд або
поки запобіжна мембрана не розірветься. Якщо мембрана не рветься,
тоді необхідно, щоб суміш вистигла, і можна було б обережно зняти
пристрій, але дотримуючись вимог безпеки, щоб не виникло зростання
тиску. З тестованою речовиною та базовими речовинами проводять
п'ять пробних тестувань. Необхідно в процесі роботи зафіксувати
час зростання тиску від 690 кПа до 2070 кПа вище атмосферного.
Вираховується середній показник часу зростання тиску.
В окремих випадках, речовини можуть сприяти зміні тиску
(занадто високого чи занадто низького), що спричиняється хімічними
реакціями, які не характеризують окислювальні властивості
речовини. Іноді може виникнути потреба в повторенні тесту з
використанням інертної речовини, наприклад, діатоміту (кізельгуру)
замість целюлози, щоб з'ясувати сутність реакції.
2. ДАНІ
Час зростання тиску, як для тестованої, так і для базової
речовини (речовин). Час зростання тиску для тестів, в яких
використовувалась інертна речовина (якщо такий тест проводився).
2.1. ОПРАЦЮВАННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Вираховується час зростання тиску, як для тестованої, так і
для базової речовини (речовин).
Середній показник часу зростання тиску для тестів, в яких
використовувалась інертна речовина (якщо такий тест проводився).
Деякі прикладів результатів наведено в Таблиці 1.
Таблиця 1
Приклади результатів(а)
------------------------------------------------------------------ | Речовина(b) | Середній показник | | | часу зростання тиску на | | | прикладі суміші з целюлозою | | | в пропорції 1:1 (мс) | |--------------------------------+-------------------------------| |Дихромат амонію, насичений | 20 800 | |водний розчин | | |Нітрат кальцію, насичений | 6 700 | |водний розчин | | |--------------------------------+-------------------------------| |Нітрат заліза, насичений | 4 133 | |водний розчин | | |--------------------------------+-------------------------------| |Перхлорат літію, насичений | 1 686 | |водний розчин | | |--------------------------------+-------------------------------| |Перхлорат магнію, насичений | 777 | |водний розчин | | |--------------------------------+-------------------------------| |Нітрат нікелю, насичений | 6 250 | |водний розчин | | |--------------------------------+-------------------------------| |Азотна кислота, 65% | 4 767(c) | |--------------------------------+-------------------------------| |Хлорна кислота, 50% | 121(c) | |--------------------------------+-------------------------------| |Хлорна кислота, 55% | 59 | |--------------------------------+-------------------------------| |Нітрат калію, 30% водний розчин | 26 690 | |--------------------------------+-------------------------------| |Нітрат срібла, насичений | (d) | |водний розчин | | |--------------------------------+-------------------------------| |Хлорат натрію, 40% водний розчин| 2 555(c) | |--------------------------------+-------------------------------| |Нітрат натрію, 45% водного | 4133 | |розчину | | |Інертна речовина | | |Вода: целюлоза | (d) | ------------------------------------------------------------------
---------------- (a) Див. посилання (1) для класифікації згідно схеми
транспортування ООН.
(b) Вологі розчини потрібно готувати при 20 град.
(c) Середній показник з міжлабораторних порівняльних тестів.
(d) Максимальний тиск 2070 кПа не отримано.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО ТЕСТУВАННЯ
Звітність про тестування має містити наступну інформацію:
- характерні особливості тестованої речовини, її склад,
наявність домішок тощо,
- концентрація тестованої речовини,
- методика висушування целюлози,
- вміст води в целюлозі,
- результати вимірювань,
- результати тестів з використанням інертної речовини, якщо
такі проводились,
- розрахунок середнього показника часу зростання тиску,
- будь-які відхилення від норм використання методу та їх
причини,
- будь-яка інформація чи зауваження щодо інтерпретації
результатів.
3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РУЗУЛЬТАТІВ(1)
---------------- (1) Див. посилання 1 про інтерпретацію результатів щодо
положень ООН про правила перевезення кількох видів базових
речовин.
Результати тестувань повинні оцінюватись на основі
наступного:
(а) здатності суміші тестованої речовини та целюлози
спонтанно спалахувати;
(b) порівняння середнього показника часу зростання тиску від
690 кПа до 2070 кПа з показниками базової речовини (речовин).
Рідина вважається окислювачем, якщо:
(а) суміш речовини та целюлози на вагу, в пропорції 1:1,
спонтанно спалахує; або
(b) суміш речовини та целюлози на вагу, в пропорції 1:1, має
середній показник часу зростання тиску менший, ніж показник суміші
целюлози та водної азотної кислоти в пропорції 1:1.
Для уникнення неправильних результатів, при потребі, під час
інтерпретації результатів необхідно враховувати результати,
отримані в ході тестування речовини з інертним матеріалом.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods,
Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication
No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for
oxidising liquids.

Малюнок 1
( 994_b14 )

Малюнок 2
( 994_b14 )

Малюнок 3
( 994_b14 )

ЧАСТИНА В: МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ТОКСИЧНОСТІ
ТА ІНШИХ НАСЛІДКІВ ДЛЯ ЗДОРОВ'Я

ЗМІСТ
ВСТУП
В.1 bis. ГОСТРА ПЕРОРАЛЬНА ТОКСИЧНІСТЬ - ПРОЦЕДУРА
ФІКСУВАННЯ ДОЗИ
В.1 tris. ГОСТРА ПЕРОРАЛЬНА ТОКСИЧНІСТЬ - МЕТОД КЛАСИФІКАЦІЇ
ГОСТРОЇ ТОКСИЧНОСТІ
В.2. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ (ВДИХАННЯ)
В.3. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ (УРАЖЕННЯ ШКІРИ)
В.4. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ: ПОДРАЗНЕННЯ ШКІРИ/РОЗ'ЇДАННЯ
В.5. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ: ПОДРАЗНЕННЯ ОКА/РОЗ'ЇДАННЯ
В.6. СЕНСИБІЛІЗАЦІЯ ШКІРИ
В.7. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ (ЯКА ВВОДИТЬСЯ
ПЕРОРАЛЬНО ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)
В.8. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ (ВВЕДЕНОЇ ЧЕРЕЗ
ІНГАЛЯЦІЮ ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)
В.9. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ (ВВЕДЕНОЇ ЧЕРЕЗ ШКІРУ
ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)
В.10. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VITRO НА ХРОМОСОМНУ АБЕРАЦІЮ
ССАВЦІВ
В.11. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VIVO НА ХРОМОСОМНУ АБЕРАЦІЮ
КІСТКОВОГО МОЗКУ ССАВЦІВ
В.12. МУТАГЕННІСТЬ - МІКРОЯДЕРНИЙ ТЕСТ IN VIVO НА
ЕРИТРОЦИТАХ ССАВЦІВ
В.13/14. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ НА ЗВОРОТНЮ МУТАЦІЮ
З ВИКОРИСТАННЯМ БАКТЕРІЙ
В.15. ДОСЛІДЖЕННЯ МУТАГЕННОСТІ ТА СКРИНІНГ НА ГЕНЕТИЧНІ
МУТАЦІЇ КАНЦЕРОГЕННОЇ ДІЇ - ПИВНІ ДРІЖДЖІ
В.16. МІТОТИЧНА РЕКОМБІНАЦІЯ - ПИВНІ ДРІЖДЖІ
В.17. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VITRO НА ГЕННУ МУТАЦІЮ
КЛІТИН ССАВЦІВ
В.18. ПОШКОДЖЕННЯ ТА РЕПАРАЦІЯ ДНК - НЕРЕПАРТИВНИЙ
СИНТЕЗ ДНК - КЛІТИНИ ССАВЦІВ IN VITRO
В.19. АНАЛІЗ ОБМІНУ СЕСТРИНСЬКИМИ ХРОМАТИДАМИ IN VITRO
В.20. РЕЦЕСИВНИЙ ТЕСТ НА ЛЕТАЛЬНІСТЬ, ПОВ'ЯЗАНУ
ЗІ СТАТЕВИМИ ВІДМІННОСТЯМИ, У ДРОЗОФІЛИ
ЧОРНОЧЕРЕВОЇ
В.21. ТЕСТИ IN VITRO НА ТРАНСФОРМАЦІЮ КЛІТИН ССАВЦІВ
В.22. ТЕСТ НА ДОМІНУВАННЯ ЛЕТАЛЬНИХ НАСЛІДКІВ У ГРИЗУНІВ
В.23. ТЕСТ НА ХРОМОСОМНУ СПЕРМАТОГОНІАЛЬНУ АБЕРАЦІЮ
ССАВЦІВ
В.24. КРАПЕЛЬНИЙ ТЕСТ НА ПІДДОСЛІДНИХ МИШАХ
В.25. СПАДКОВА ТРАНСЛОКАЦІЯ У МИШЕЙ
В.26. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ПЕРОРАЛЬНУ ТОКСИЧНІСТЬ ПРИ
ПОВТОРЮВАНІЙ ДОЗІ:
90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕРОРАЛЬНОЇ ТОКСИЧНОСТІ НА
ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
В.27. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ПЕРОРАЛЬНУ ТОКСИЧНІСТЬ ПРИ
ПОВТОРЮВАНІЙ ДОЗІ:
90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕРОРАЛЬНОЇ ТОКСИЧНОСТІ
НЕ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
В.28. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ДЕРМАЛЬНУ ТОКСИЧНІСТЬ:
90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ З ПОВТОРЮВАНОЮ ДЕРМАЛЬНОЮ
ДОЗОЮ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
В.29. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ТОКСИЧНІСТЬ ПРИ ВДИХАННІ:
90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ З ПОВТОРЮВАНОЮ ДОЗОЮ ДЛЯ
ВДИХАННЯ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
В.30. ТЕСТ НА ХРОНІЧНУ ТОКСИЧНІСТЬ
В.31. ДОСЛІДЖЕННЯ ДІЇ ТОКСИЧНИХ РЕЧОВИН НА ПРЕНАТАЛЬНИЙ
РОЗВИТОК
В.32. ТЕСТ-ПРОБА НА КАНЦЕРОГЕННІСТЬ
В.33. КОМБІНОВАНИЙ ТЕСТ НА ХРОНІЧНУ
ТОКСИЧНІСТЬ/КАНЦЕРОГЕННІСТЬ
В.34. ДОСЛІДЖЕННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ТОКСИЧНОСТІ ОДНОЇ
ГЕНЕРАЦІЇ
В.35. ДОСЛІДЖЕННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ТОКСИЧНОСТІ ДВОХ
ГЕНЕРАЦІЙ
В.36. ТОКСИКОКІНЕТИКА
В.37. ЗАТРИМАНА НЕЙРОТОКСИЧНІСТЬ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН
ПІСЛЯ ЗНАЧНОЇ ЕКСПОЗИЦІЇ
В.38. 28-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЗАТРИМАНОЇ НЕЙРОТОКСИЧНІСТІ
З ПОВТОРЮВАНОЮ ДОЗОЮ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН
В.39. ДОСЛІДЖЕННЯ ПОЗАПЛАНОВОГО/РЕПАРАТИВНОГО СИНТЕЗУ ДНК
НА КЛІТИНАХ ПЕЧІНКИ ССАВЦІВ IN VIVO
B.40. РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ IN VITRO: ТЕСТ НА ОПІР ДІЇ
ЕЛЕКТРИЧНОГО СТРУМУ ЧЕРЕЗ ШКІРУ (ТОДЕСЧШ)
В.40.BIS РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ IN VITRO: ДОСЛІДЖЕННЯ ЗРАЗКА
ЛЮДСЬКОЇ ШКІРИ
В.41. ТЕСТ НА ФОТОТОКСИЧНІСТЬ 3Т3 NRU IN VITRO
В.42. ЧУТЛИВІСТЬ ШКІРИ: АНАЛІЗ РЕАКЦІЇ ІЗОЛЬОВАНИХ ВУЗЛІВ
В.43. ДОСЛІДЖЕННЯ НЕЙРОТОКСИЧНОСТІ НА ГРИЗУНАХ
В.44. АБСОРБЦІЯ ЧЕРЕЗ ШКІРУ: МЕТОД IN VIVO
В.45. АБСОРБЦІЯ ЧЕРЕЗ ШКІРУ: МЕТОД IN VITRO
ВСТУП
А. ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТОВАНОЇ РЕЧОВИНИ
Перед початком вивчення токсичності необхідно отримати
інформацію щодо складу тестованої речовини, включаючи найбільші
домішки, дані про відповідні фізичні й хімічні властивості
речовини, її стабільність.
Інформація про фізичні й хімічні властивості речовини є
важливою при виборі методу управління та проведення кожного
окремого тесту, а також, коли йдеться про умови зберігання та
обробки самої речовини.
Також перед початком експерименту необхідно врахувати процес
розробки методу кількісного та якісного визначення/вимірювання
тестованої речовини в дозаторі та біологічному матеріалі.
Звітність про тестування повинна містити всю інформацію щодо
ідентифікації, фізичних і хімічних властивостей речовини, а також
наявності домішок і поведінки в ході експерименту.
B. ДОГЛЯД ЗА ТВАРИНАМИ
Під час проведення перевірки на токсичність необхідно суворо
контролювати умови, в яких знаходяться піддослідні тварини.
(i) Умови утримання
Кліматичні умови в приміщеннях та корпусах з піддослідними
тваринами повинні відповідати умовам, що є необхідними для
піддослідних видів. Так, для щурів, мишей і морських свинок,
задовільними вважатимуться температурні умови в межах 22 град.С
+- 3 град.С, з відносною вологістю повітря 30-70%; для кролів
задовільними вважатимуться температурні умови в межах 20 град.С
+- 3 град.С, з відносною вологістю повітря 30-70%.
Оскільки деяке експериментальне обладнання досить чутливе до
впливу температури, необхідно включати певну інформацію щодо
відповідних умов тестування в матеріали про проведення тестування.
Під час проведення тесту потрібно контролювати, записувати та
включати в остаточний звіт показники температури.
Освітлення повинно бути штучним, з наступним інтервалом:
12 годин - світло, 12 годин - темно. Деталі щодо освітлення
записують і доповіді вносять до підсумкового звіту про результати
експерименту.
Тварин у клітках розміщують окремо або малими групами, що
складаються з особин однієї статі (не більше п'яти особин в одній
клітці), якщо інше не передбачено умовами експерименту.
Звіти про результати експериментів над тваринами повинні
включати інформацію про тип кліток і кількість тварин, що
утримуються в кожній з цих кліток, як під час дії хімічного
препарату, так і в ході подальших спостережень.
(ii) Умови годування
Корм для тварин повинен відповідати всім вимогам харчування
того виду тварин, над якими проводяться експерименти. Якщо в ході
тесту тваринам дають певні хімічні речовини, зміни поживної
цінності їх корму можна пояснити взаємодією речовини та харчового
компоненту. Необхідно зважати на можливість отримання такого
результату під час інтерпретації результатів. Застосовують
звичайний лабораторний корм та необмежену кількість питної води.
Вибір харчового раціону тварин повинен бути таким, щоб це
відповідало особливостям зазначеної тестованої речовини. Якщо в
кормі тварин є домішки та сторонні елементи, які можуть впливати
на токсичність, тоді необхідно, щоб їх концентрація не впливала
негативно на проведення тесту та інтерпретацію результатів.
C. АЛЬТЕРНАТИВНІ МЕТОДИ ТЕСТУВАННЯ
Європейський Союз наполегливо працює над розвитком та
впровадженням альтернативних методик тестування, які можуть надати
ту саму інформацію, що й сучасні методи, але використовуючи при
цьому менше тварин, і таким чином, завдаючи їм менше шкоди або
намагаючись уникнути використання тварин взагалі.
Якщо буде можливо впроваджувати такі нові методики, тоді,
відповідно, необхідно враховувати такі моменти, як експлуатаційна
безпека, подальша класифікація, маркування властивих тесту
небезпек та оцінка хімічної безпеки.
D. ОЦІНКА ТА ІНТЕРИРИТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Після первинної оцінки та інтерпретації результатів тестів
необхідно врахувати те, що результати тестів, як тварин, так і
пробірок передаються потім спеціалісту. Отже, можливо, що в
процесі підтвердження остаточного результату, негативну роль може
зіграти людський фактор.
E. ЛІТЕРАТУРА
Більшість даних методів розроблено в рамках програми ОЕСР
щодо рекомендацій для проведення тестів, і, відповідно, необхідно
дотримуватись принципів Апробованих лабораторних методів для того,
щоб якомога ширше використовувати "взаємно прийнятні дані".
Додаткову інформацію можна переглянути в посиланнях, які є в
рекомендаційних матеріалах ОЕСР та іншій опублікованій літературі.
В.1 bis. ГОСТРА ПЕРОРАЛЬНА
ТОКСИЧНІСТЬ - ПРОЦЕДУРА ФІКСУВАННЯ ДОЗИ
1. МЕТОД
Даний метод тестування є еквівалентним ТІ (ТЕСТОВИХ
ІНСТРУКЦІЙ) ОЕСР 420 (2001)
1.1. ВСТУП
У традиційних методах оцінки пероральної токсичності тварини
наприкінці експерименту помирають. У 1984 році Британським
токсикологічним товариством було запропоновано новий метод оцінки
пероральної токсичності, в основі якого лежить фіксування доз (1).
Завдяки цьому методу вдалось уникнути смерті тварин наприкінці
експерименту. В основі методу тепер було спостереження за явними
ознаками токсичності на прикладі одного з видів фіксованих доз. У
результаті міжнародних лабораторних оціночних тестів у пробірці та
експериментів, що проводились у Сполученому Королівстві
Великобританії та Північної Ірландії, у 1992 році нововведену
методику було затверджено, як новий метод тестування. Потім було
зроблено оцінку статистичних якостей Методики фіксованих доз,
використовуючи в ході дослідження математичні моделі (4)(5)(6).
Також, результати тестів на прикладі живих організмів та
математичних моделей показали, що така нововведена методика є
продуктивною, оскільки в ній задіяно менше тварин, які вже не так
страждають під час таких експериментів, на відміну від попередніх
тестів, а також є можливість класифікувати речовини подібно до
інших методів оцінки гострої токсичності.
У Рекомендаційних матеріалах про гостру пероральну
токсичність (7) міститься інформація щодо вибору найвідповіднішого
методу тестування з заданої теми. У даному документі також дається
додаткова інформація щодо проведення та інтерпретації результатів
методу тестування В.1 bis.
В основі методу лежить принцип застосування помірно токсичних
доз в ході експерименту. Слід уникати використання таких доз, в
результаті дії яких можливий летальний кінець. Непотрібно
застосовувати дози, які подразнюють та роз'їдають організм і
викликають сильний біль та нездужання. Необхідно якомога гуманніше
позбавити життя помираючих тварин, а також тих, які вже довгий час
страждають від нездужання та сильного болю. Щодо інтерпретації
результатів тестів, в яких тварини були вимушено позбавленні
життя, то вони враховуються так само, як і результати тих
експериментів, в яких тварини померли самі. Рекомендаційні
матеріали (8) містять критерії прийняття рішень щодо позбавлення
життя помираючих та страждаючих тварин, а також інформацію
стосовно ознак передбачуваної або очікуваної смерті.
У даному методі подається інформація щодо шкідливих та
небезпечних властивостей речовин, а також те, як ці речовини
необхідно групувати та класифікувати, відповідно до Глобальної
Гармонізованої Системи (ГГС) класифікації хімічних речовин, які
викликають гостру токсичність (9).
Перед початком тестування речовини в умовах лабораторії
необхідно брати до уваги всю інформацію, що стосується взятого
хімікату. Сюди входить інформація щодо характерних особливостей
речовини, її хімічного складу; токсичні дані структурно пов'язаних
речовин; передбачуване застосування хімікату. Така інформація є
необхідною для того, щоб можна було підібрати відповідну початкову
дозу і переконатись в тому, що здоров'ю людини нічого не загрожує.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Гостра пероральна токсичність: стосується перорального
вживання однієї або кількох доз речовини протягом 24 годин, в
результаті чого з'являються шкідливі побічні ефекти.
Запізніла смерть: це означає, що піддослідна тварина не
помирає або знаходиться в передсмертному стані протягом 24 годин,
але вмирає пізніше - протягом 14-тиденного періоду ведення
спостережень.
Доза: кількість застосовуваної хімічної речовини. Доза
виражається в одиницях ваги взятого хімікату на вагу піддослідної
тварини (наприклад, мг/кг).
Очевидна токсичність:загальний термін, який вказує на явні
ознаки токсичності, що виникли в результаті застосування
тестованої речовини (див. приклад в (3)), і після наступної
найбільшої фіксованої дози це може призвести до того, що тварини
будуть страждати від сильного болю та явного сильного нездужання;
також можливо, що тварини будуть знаходитись у передсмертному
стані (критерії подано в Рекомендаціях щодо Гуманності (8)) або
слід очікувати ймовірної смерті більшої частини піддослідних
тварин.
ГГС: Глобально Гармонізована Система (ГГС) класифікації
хімічних речовин та сумішей, які викликають гостру токсичність.
Спільна діяльність ОЕСР в галузі охорони навколишнього середовища
та життя людини, Експертного комітету ООН з транспортування
небезпечних речовин (вивчення фізико-хімічних властивостей) і
Міжнародної організації праці (МОТ) (використання небезпечних
матеріалів) координується Міжорганізаційною програмою
раціонального застосування хімічних речовин (МПРЗХР).
Ймовірна смерть: стан, коли піддослідна тварина вмирає або
очікується, що вона помре до наступного очікуваного моменту
спостереження. Ознаками такого стану для щурів є, наприклад, поява
конвульсій, перевертання набік, лежаче положення та тремтіння.
Додаткова інформація міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності(8).
Напівлетальна доза: НД (коли гине 50% особин): статистично
50 взята повна доза хімічної речовини, в результаті дії якої
очікується летальний кінець у 50% тварин, які приймали хімікат
перорально. Показник НД виражається в одиницях ваги тестованої
50 речовини на вагу піддослідної тварини (мг/кг).
Допустима доза: допустима доза під час тестування (2000 або
5000 мг/кг).
Передсмертний стан: стан, коли тварина вмирає або не може
вижити навіть при наданні медичної допомоги. Додаткова інформація
міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності (8).
Очікувана смерть: наявність клінічних ознак, які вказують на
наближення летального результату у визначений час задовго до
запланованого часу завершення експерименту. Наприклад: тварина
нездатна дотягнутись до їжі або води. Додаткова інформація
міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності (8).
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Групам тварин однієї статі дають дози хімічної речовини
поступово: фіксовані дози по 5, 50, 300 та 2000 мг/кг (в окремих
випадках дозволяється давати 5000 мг/кг - див. пункт 1.6.2.).
Рівень дозування вираховується візуально і так, щоб введена доза
речовини призвела лише до певних ознак токсичності, не спричинивши
при цьому серйозної гострої токсичності або смерті тварин. У
Рекомендаціях ОЕСР (8) подано перелік клінічних ознак та умов, що
вказують на виникнення болю, страждання та очікувану смерть.
Наступним групам тварин дозування збільшують до більшого/меншого
фіксованого рівня, в залежності від того, чи є ознаки токсичності
або смерті. Така процедура продовжується до тих пір, поки не буде
визначено саме ту дозу, яка спричиняє очевидну токсичність чи,
принаймні, одну смерть. Також, експеримент продовжується, якщо
після застосування найбільшої дози не виявлено жодних ефектів або
тварини вмирають після з'їдання найменшої дози хімічної речовини.
1.4. ОПИС МЕТОДУ
1.4.1. Підбір видів тварин
Найкращим з виду гризунів є щур, хоча можна також
застосовувати інших представників цього виду. Як правило,
використовують самок (7), оскільки результати сучасних тестів НД
50
та спеціалізована література говорять про те, що, зазвичай, хоча
різниця між чутливістю статей невелика, проте, якщо такі
відмінності все ж спостерігаються, самки виявляються до певної
міри чутливішими (10). Однак, якщо в результаті вивчення токсичних
або токсикокінетичних властивостей структурно пов'язаних хімічних
речовин виявиться, що самці можуть бути чутливішими, тоді перевага
надається цій статі. Під час використання в тестах самців
необхідно обумовлювати доцільність їх застосування.
1.4.2. Умови утримування та годування тварин
Температура в експериментальних приміщеннях, де утримують
тварин повинна бути в межах 22 град.С (+- 3 град.С). Незважаючи на
те, що відносна вологість повітря повинна бути, принаймні, 30% та,
якщо можливо, не перевищувати 70%, за винятком, коли приміщення
прибирають, необхідно намагатись, щоб цей показник був 50-60%.
Освітлення має бути штучним, з інтервалом 12 годин (світло-темно).
Що стосується сучасного годування тварин в лабораторних умовах, то
необхідно, щоб в їх раціоні кількість питної води не обмежувалась.
Тварин групують в клітках, згідно дозування, але важливо, щоб
кількість особин в одній клітці не заважала нормальному
спостереженню за кожною з них.
1.4.3. Підготовка тварин
Тварин обирають навмання, маркують для індивідуальної
ідентифікації та тримають в клітках не менше п'яти днів перед
початком дозування для того, щоб вони окліматизувались у
лабораторних умовах.
1.4.4. Підготовка доз
Загалом, об'єм дози повинен бути постійним стосовно інших
видів доз, які застосовуватимуться в експерименті, але
відрізнятись концентрацією приготування. Коли тестують кінцевий
продукт рідини, то може виявитись, що застосування нерозбавленої
речовини, наприклад, при сталій концентрації, є важливішим в
процесі оцінки ризиків, які спричиняє така речовина, і така вимога
існує з боку деяких керівних органів. У будь-якому випадку
максимальний об'єм дози не можна збільшувати.
Максимальний об'єм дози, яку можна застосовувати один раз,
залежить від розмірів піддослідної тварини. Так, для щурів цей
об'єм, як правило, на повинен перевищувати 1 мл/100 г ваги тіла:
проте, якщо застосовуються водний розчин, тоді можна за основу
взяти показник ваги тіла в 2 мл/100 г. Що стосується самої
рецептури приготування дози, то, якщо можливо, рекомендується
водний розчин/суспензія/емульсія, які додаються в залежності від
того, як розчиняється суспензія/емульсія в олії (наприклад,
кукурудзяній) та інших технологічних рідинах. Коли
використовуються інші технологічні рідини (не вода), тоді
необхідно ознайомитись з їх характерними особливостями. Дози
потрібно готувати безпосередньо перед їх застосуванням, якщо
невідома інформація щодо стабільності приготування на певний
період часу, протягом якого ці дози будуть використані та
вважатимуться придатними для застосування.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Застосування/введення доз
Введення дози відбувається методом штучного годування через
зонд або введенням трубки в орган. В окремих випадках, коли повну
дозу ввести не вдається, її розбивають на менші частини, на
період, який не перевищує 24 години.
Перед дозуванням тварин утримують від їжі наступним чином:
наприклад, щурам дають на ніч лише воду, мишам дають воду, а їсти
не дозволяють 3-4 години. Після такого утримання від їжі тварин
зважують, а потім вводять необхідну дозу хімічної речовини. Потім,
наступні 3-4 години щурів знову утримують від їжі, а мишей
1-2 години. Якщо дозування розбивається на частини, протягом
певного періоду, тварин за необхідності годують і дають воду, в
залежності від тривалості такого періоду дозування.
1.5.2. Візуальна перевірка
Завдання візуальної перевірки полягає у виборі відповідної
початкової дози для головного експерименту. Тестована хімічна
речовина вводиться окремим тваринам так, як показано в блок-схемі
Додатку 1. Візуальна перевірка закінчується тоді, коли прийнято
рішення щодо розмірів початкової дози для головного експерименту
(або, якщо при найменшій фіксованій дозі трапляється летальний
кінець).
Початкова доза для візуальної перевірки береться на основі
рівнів фіксованої дози в 5, 50, 300 та 2000 мг/кг. Це доза, від
якої повинна наступати очевидна токсичність, про що мають свідчити
дані лабораторних тестів (в пробірках та на прикладі живих
організмів), де застосовувались такі самі хімікати, а також
структурно подібні до них. За відсутності такої інформації,
початкова доза хімічної речовини повинна становити 300 мг/кг.
Період між дозуванням кожної тварини повинен бути не менше
24 годин. Тварин необхідно оглядати протягом, принаймні, 14 днів.
Лише в окремих випадках, і, якщо в цьому є потреба та
доцільність, дозволяється збільшувати рівень фіксованої дози до
5000 мг/кг (див. Додаток 1). З метою охорони тварин забороняється
тестування методом ГГС, Категорії 5, в межах доз 2000-5000 мг/кг.
Єдиним винятком може бути обґрунтована доцільність такого методу,
якщо є велика впевненість в тому, що результати тесту мають прямий
зв'язок з проблемами охорони навколишнього середовища та здоров'я
людини.
У випадку, якщо в результаті візуального тестування при
найменшому рівні фіксованої дози (5 мг/кг) тварина помирає,
необхідно припинити експеримент та призначити до застосування
речовину методу ГГС, Категорії 1 (як в Додатку 1). Проте, якщо
необхідне подальше підтвердження класифікації, можна провести
наступну додаткову процедуру. Вводиться доза другій тварині, з
розрахунку 5 мг/кг. Якщо тварина помирає, тоді метод ГГС,
Категорії 1 підтверджується, а експеримент одразу припиняється. У
випадку, коли друга тварина виживає, беруть ще не менше трьох
тварин для дозування, з розрахунку 5 мг/кг. Враховуючи, що ризик
летального випадку дуже високий, цих тварин дозують послідовно, з
метою гуманного ставлення до них та охорони життя. Інтервал між
дозуванням кожної з тварин повинен бути достатнім для того, щоб
переконатись, що перша тварина виживе після отриманої дози. Якщо
за другим разом тварина помирає, порядок дозування одразу
припиняють, а інших тварин також не дозують. Оскільки інцидент з
другим летальним випадком (незалежно від кількості протестованих
тварин на момент припинення тесту) підпадає під категорію А (дві
або більше смертей), вступає в дію правило класифікації, як в
Додатку 2 (розрахунок фіксованої дози 5 мг/кг) (Категорія 1, якщо
одна або більше смертей або Категорія 2, якщо лише один летальний
кінець). Крім того, в Додатку 1 містяться рекомендації щодо
класифікації за системою ЄС до тих пір, поки не буде запроваджено
нового ГГС.
1.5.3. Основний експеримент
1.5.3.1. Кількість тварин та рівні дозування
Дія, яка наступає після тестування із застосуванням
початкової дози, вказана у блок-схемі Додатку 2. Одна з трьох дій
є обов'язковою; необхідно або припинити тестування та призначити
відповідний тест для класифікації ризиків, використавши при цьому
більшу фіксовану дозу, або проводити експеримент при меншій
фіксованій дозі. Проте, з метою захисту тварин, необхідно, щоб та
доза хімікату, яка спричинила смерть тварини в ході візуального
тесту, не застосовувалась повторно в головному тесті (див.
Додаток 2). Досвід показує, що при застосуванні початкової дози
найймовірнішим буває результат, коли хімічну речовину вдається
класифікувати, і продовження експерименту далі непотрібно.
Для дослідження дії кожного рівня дози беруть, як правило, до
п'яти тварин однієї статі. До складу цієї групи з п'яти тварин
входить одна тварина з візуального тесту, яку дозували згідно
певного рівня дози, а також решта чотири тварини (крім ситуації,
хоча таке малоймовірно, коли рівень дози з основного експерименту
не було включено у візуальний тест).
Інтервал між дозуваннями кожного рівня визначається появою,
тривалістю та складністю ознак токсичності. Надання медичної
допомоги тваринам слід відкласти, поки не буде впевненості в тому,
що вижили тварини, дозовані раніше. Рекомендується, щоб період між
дозуваннями на кожному рівні складав, якщо необхідно, 3-4 дні, щоб
провести спостереження сповільнення токсичності. Цей інтервал
можна збільшити при необхідності, наприклад, у випадку отримання
невпевнених результатів.
Коли застосовується збільшене фіксоване дозування в
5000 мг/кг, необхідно перейти до процедури, описаної в Додатку 3
(див. також секцію 1.6.2).
Граничний тест
Граничний тест головним чином застосовують в ситуаціях, коли
в експериментатора є інформація про те, що тестований матеріал
очевидно виявиться нетоксичним, тобто, матиме показник токсичності
в межах допустимих норм .Інформацію стосовно токсичності матеріалу
можна отримати з даних про тестування подібних хімічних речовин,
сумішей або продуктів, враховуючи також характеристику та
процентне співвідношення компонентів, що можуть виявитись
токсичними. У подібних ситуаціях, коли майже немає інформації про
токсичність або, якщо така токсичність очікується в застосованому
матеріалі, необхідно проводити повне тестування (основний тест).
В якості рекомендації слід зазначити, що граничним тестом за
нормальних умов буде візуальний тест при дозуванні 2000 мг/кг (або
5000 мг/кг в окремих випадках).
1.6. СПОСТЕРЕЖЕННЯ
Тварин спостерігають індивідуально після дозування, хоча б
раз протягом перших 24 годин, звертаючи особливу увагу на перші
чотири години. Потім спостерігають щодня, загалом 14 днів, крім
ситуацій, коли експеримент припиняють, а тварин позбавляють життя
з міркувань гуманності, або, якщо тварин знайдено вже мертвими.
Проте, тривалість експерименту непотрібно суворо задавати в певні
часові рамки. Тривалість повинна обумовлюватись токсичними
реакціями, початком та тривалістю відновлювального періоду та може
при потребі розтягуватись. Дуже важливим є зафіксувати, коли
з'являються та зникають ознаки токсичності, особливо, якщо є
тенденція запізнілої появи таких ознак(11). Результати
спостережень систематично записують, затверджуючи їх стосовно
кожної тварини.
Додаткові спостереження необхідно проводити, якщо тварини
продовжують проявляти ознаки токсичності. У процесі спостережень
потрібно виявити зміни на шкірі, шерсті, очах, слизовій оболонці,
а також в дихальній системі, системі кровообігу, вегетативній та
центральній нервовій системі. Також спостерігаються зміни в
соматомоторній діяльності та поведінці. Необхідно уважно
слідкувати за тим, чи з'являються тремтіння та конвульсії,
виділення слини, діарея, впадання в летаргічний сон та кому.
Керуватись необхідно критеріями, поданими в Рекомендаціях щодо
Гуманності (8). Тварин, які перебувають в передсмертному стані або
страждають від сильного болю та недомагань, необхідно позбавляти
життя гуманним способом. Якщо тварин позбавлено життя з гуманних
міркувань або знайдено вже мертвими, необхідно обов'язково якомога
точніше вказати час смерті.
1.6.1. Вага тіла
Вагу тіла тварин необхідно визначити незадовго до початку
дозування, а також через тиждень після цього. Будь-які зміни у
вазі потрібно вираховувати та записувати. Тварин, які вижили, в
кінці експерименту зважують, а потім гуманно позбавляють життя.
1.6.2. Патологія
Всім тваринам (навіть тим, які померли під час тесту або були
усунуті від подальшого експерименту з гуманних міркувань) роблять
загальний розтин. Результати загальних патологічних змін записують
стосовно кожної тварини окремо. До уваги беруться і результати
мікроскопічного дослідження органів, в яких виявлено ознаки
загальної патології. Йдеться про тварин, які вижили через 24 або
більше годин після першого дозування. Такі результати можуть
виявитись досить важливими.
2. ДАНІ
Подаються дані стосовно кожної тварини окремо. Крім того, всю
інформацію підсумовують у вигляді таблиці, вказуючи кількість
тварин кожної тестованої групи, кількість тварин, в яких виявлено
ознаки токсичності, кількість тварин, померлих в ході експерименту
або позбавлених життя з гуманних міркувань. Фіксується також час
смерті окремих тварин, опис та час появи ознак токсичності й
зворотного процесу, а також результати розтину.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ТЕСТУ
Звітність про результати тесту має містити наступну
інформацію:
Тестована речовина:
- характерні особливості, наявність домішок і, якщо
необхідно, фізико-хімічні властивості (включаючи ізомеризацію),
- дані ідентифікації та номер CAS.
Технологічна рідина (якщо є доцільність):
- якщо використовується інша технологічна рідина, ніж вода,
тоді обґрунтувати доцільність такого застосування.
Тварини для експерименту:
- вид/рід тварин,
- мікробіологічний статус тварин, якщо відомо,
- кількість, вік та стать тварин (включаючи, якщо потрібно,
обґрунтування вибору самців замість самок),
- інформація про те, звідки тварини, умови утримування, корм
тощо.
Умови проведення тесту:
- інформація щодо рецептури/складу речовини, включаючи деталі
фізичної форми застосовуваного матеріалу,
- деталі застосування тестованої речовини, включаючи дані про
об'єми та час дозувань,
- інформація про якість їжі та води (також, тип
раціону/корму, походження, походженні води),
- обґрунтування вибору початкової дози.
Результати:
- результати щодо отриманої інформації та рівень дози для
кожної тварини (наприклад, тварини з ознаками токсичності; також
дані про смертність, особливості, труднощі та тривалість ефектів),
- введення в таблицю даних про вагу та зміни у вазі,
- індивідуальна вага тварин в день дозування, з тижневими
інтервалами, та в момент смерті або під час настання конвульсій та
страждань,
- дата і час смерті, якщо остання наступила до початку
страждань тварини,
- початок та період тривалості токсичних ознак, і чи не має
це зворотної дії на кожну з тварин,
- результати загального та гістопатологічного розтину кожної
тварини, якщо такі результати є.
Обговорення та інтерпретація результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity
(1984) Special report: a new approach to theclassification of
substances and preparations on the basis of their acute toxicity.
Human Toxicol., 3, p. 85-92.
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R. O
(1987) Evaluation of the BTS approach to the testing of substances
and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6,
p. 279-291.
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J.,
Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J.
and Walker, A.P (1990) The international validation of a
fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test.
Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469-482.
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N (1992) Statistical
evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30,
p. 313-324.
(5) Stallard, N. and Whitehead, A (1995) Reducing numbers in
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, p. 315-323.
(6) Stallard, N., Whitehead, A and Ridgeway, P. (2002)
Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum.
Exp. Toxicol., 21, p. 183-196.
(7) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on
Testing and Assessment No 24. Paris
(8) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition,
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19.
(9) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification
for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances
as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee
and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11
(http: //webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,
EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html).
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D.,
Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L.,
Springer, J.A. and Myers, R.C (1995) Comparison of the
Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223-231.
(11) Chan P.K and A. W Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd. New York, USA.

Додаток 1
( 994_b14 )

Додаток 2
( 994_b14 )

Додаток 3

КРИТЕРІЇ КЛАСИФІКАЦІЇ ТЕСТОВАНИХ РЕЧОВИН
З ОЧІКУВАНИМИ ПОКАЗНИКАМИ НД БІЛЬШЕ 2000 МГ/КГ
50
БЕЗ НЕОБХІДНОСТІ ТЕСТУВАННЯ

Критерії небезпеки Категорії 5 необхідні для того, щоб можна
було ідентифікувати тестовані речовини, рівень токсичності яких
досить низький, але які за певних обставин можуть становити
небезпеку вразливим групам людей. Очікувані показники НД при
50 пероральному або шкірному подразненні становитимуть
2000-5000 мг/кг або відповідатимуть еквівалентним дозам інших
напрямків тестувань. Тестовані речовини можна було б класифікувати
згідно категорії небезпеки так: 2000 мг/кг < НД < 5000 мг/кг
50 (Категорія 5 в ГГС). Класифікація можлива в наступних випадках:
(а) якщо на таку категорію вказують схеми тестування
Додатку 2 на основі летальних випадків,
(b) якщо є достатньо доказів того, що НД знаходиться в
50
межах показників Категорії 5; або, якщо дослідження інших
токсичних ефектів в тварин вказують на те, що можлива реальна
велика загроза життю людини;
(c) методом екстраполяції, оцінки або вимірювання даних, якщо
не підтверджується зарахування речовини до класу більш загрозливих
хімікатів, а також
- коли є достовірна інформація про те, що було виявлено
гострі токсичні ознаки в людей або
- мав місце летальний кінець під час тестування до показників
Категорії 4 шляхом перорального введення, чи
- у разі експертного підтвердження того, що з'явились ознаки
токсичності під час тестування до показників Категорії 4, за
винятком тестів на вияв діареї, пілоерекції або інших невизначених
ознак, або
- якщо в разі експертного підтвердження виявиться, що можливі
гострі ознаки токсичності, отримані в інших експериментах над
тваринами.
ТЕСТУВАННЯ ПРИ ДОЗАХ, ЩО ПЕРЕВИЩУЮТЬ 2000 МГ/КГ
В окремих випадках, а також тоді, коли цього вимагають
специфічні умови, дозволяється розглядати можливість дозування на
додатковому рівні більшої фіксованої дози в 5000 мг/кг. З
міркувань охорони тварин та гуманного ставлення до них
забороняється тестування при 5000 мг/кг, за винятком, якщо є
велика ймовірність того, що результати такого тестування матимуть
прямий зв'язок з проблемами охорони тварин та життя людини (9).
Візуальний експеримент
Правила прийняття рішень, які регулюють процедуру, описану в
Додатку 1, доповнюються таким чином, щоб можна було використати
дозу 5000 мг/кг. Якщо ж використання дози 500 мг/кг призводить до
результату А (смерть), необхідно зменшити дозу для другої тварини
до 200 мг/; результати Б та В (очевидна токсичність або її
відсутність) дають змогу вибрати дозу в 5000 мг/кг, як головну
початкову дозу. Так само, якщо використовується доза, відмінна від
5000 мг/кг, тестування продовжують до використання дози
5000 мг/кг, якщо отримано результати Б та В під час використання
дози 2000 мг/кг; наступний результат А під час застосування дози
5000 мг/кг диктуватиме початкову доза головного експерименту
2000 мг/кг, а результати Б та В - початкову дозу основного
тестування на рівні 5000 мг/кг.
Основний експеримент
Візуальний експеримент
Правила прийняття рішень, які регулюють процедуру, описану в
Додатку 2, доповнюються таким чином, щоб можна було використати
дозу 5000 мг/кг. Так, якщо застосовується початкова доза основного
експерименту 5000 мг/кг, тоді результати А (>= 2 летальних
випадки) вимагатимуть тестування другої групи з використанням
дози, що становить 2000 мг/кг; результат Б (очевидна токсичність
та/або <= 1 летальний кінець) або В (відсутність токсичності)
призведе до того, що речовину не класифікують за ГГС. Так само,
якщо використовується доза, відмінна від 5000 мг/кг, тестування
проводять до використання 5000 мг/кг, якщо В становитиме
2000 мг/кг; наступний результат А при використання дози 5000 мг/кг
призведе до призначення речовині Категорії 5, а результати Б
та В - до декласифікації речовини.

Додаток 4
( 994_b14 )

В.1.tris. ГОСТРА ПЕРОРАЛЬНА ТОКСИЧНІСТЬ - МЕТОД
КЛАСИФІКАЦІЇ ГОСТРОЇ ТОКСИЧНОСТІ
1. МЕТОД
Даний метод є еквівалентним ТІ (ТЕСТОВИХ ІНСТРУКЦІЙ) ОЕСР
(2001)
1.1. ВСТУП
Метод класу гострої токсичності (1), наведений у даному
тесті, є поетапною процедурою, коли використовується 3 тварини.
Приблизно, 2-4 етапи можуть знадобитись, щоб визначити ознаки
гострої токсичності в тестованій речовині, в залежності від
смертності та ознак наближеної смерті тварин. Цей метод є
відтворюваним, в ньому використовують лише кількох тварин, можна
класифікувати хімічні речовини так само, як і в інших методах
дослідження гострої токсичності. Метод класу гострої токсичності
заснований на біометричних показниках (2)(3)(4)(5) фіксованих доз,
окремо розподілених так, щоб речовину можна було класифікувати та
оцінити ступінь небезпеки. Прийнятий в 1996 році метод було
ретельно перевірено на живих організмах стосовно показника НД ,
50
як вказано у національний (6) та міжнародній літературі (7).
Рекомендації щодо вибору найвідповіднішого методу тестування
для даного завдання можна віднайти в Рекомендаційних Матеріалах з
визначення Гострої Пероральної Токсичності (8). Дані Рекомендації
також містять додаткову інформацію про проведення та інтерпретацію
результатів методу В.1 частина третя.
Непотрібно застосовувати дози, які подразнюють та роз'їдають
організм і викликають сильний біль та нездужання. Необхідно
якомога гуманніше позбавити життя помираючих тварин, а також тих,
які вже довгий час страждають від нездужання та сильного болю.
Результати, отримані в процесі тестування таких тварин, беруться
до уваги так само, як і результати тестування тих, які померли
самі. У Рекомендаційних матеріалах міститься інформація про
критерії для прийняття рішень щодо того, як позбавити життя
помираючих тварин, а також тих, які вже довгий час страждають від
нездужання та сильного болю (9).
У методі використовуються заздалегідь визначені дози, а
результати дають змогу класифікувати речовину у відповідності до
Глобальної Гармонізованої Системи класифікації хімічних речовин
гострої токсичності (10).
Загалом, в даному методі не ставиться мета визначити точний
показник НД , але можна визначити певні межі дії, при яких
50 очікується летальний кінець, оскільки смерть певних тварин є
основним закінченням тестів. Метод дає змогу визначити показник
НД лише тоді, коли смертність перевищує 0% та менша за 100% і є
50 спричиненою двома дозами. Застосування заздалегідь визначених доз
будь-якої речовини та класифікації лише певної кількості тварин,
яких спостерігали в різних станах, покращує можливість лабораторії
отримати певну послідовність та відтворювання.
Лабораторія для тестувань повинна звертати увагу на всю
можливу інформацію стосовно тестованої речовини. Сюди входить
окремий хімічний склад речовини; її фізико-хімічні властивості;
результати тестувань на токсичність, як в пробірці, так і на живих
організмах; токсикологічні дані про структурно подібні речовини;
призначення речовини. Така інформація є необхідною для того, щоб
переконатись в тому, що даний тест відповідає вимогам охорони
здоров'я людини та дає змогу визначити найвідповіднішу початкову
дозу.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Гостра пероральна токсичність: стосується перорального
вживання однієї або кількох доз речовини протягом 24 годин, в
результаті чого з'являються шкідливі побічні ефекти.
Запізніла смерть: це означає, що піддослідна тварина не
помирає або знаходиться в передсмертному стані протягом 48 годин,
а вмирає пізніше - протягом 14-тиденного періоду ведення
спостережень.
Доза: кількість застосовуваної хімічної речовини. Доза
виражається в одиницях ваги взятого хімікату на вагу піддослідної
тварини (наприклад, мг/кг).
ГГС: Глобально Гармонізована Система (ГГС) класифікації
хімічних речовин та сумішей, які викликають гостру токсичність.
Спільна діяльність ОЕСР в галузі охорони навколишнього середовища
та життя людини, Експертного Комітету ООН з Транспортування
Небезпечних Речовин (вивчення фізико-хімічних властивостей) і
Міжнародної Організації Праці (МОТ) (використання небезпечних
матеріалів) координується Міжорганізаційною Програмою
Раціонального Застосування Хімічних Речовин (МПРЗХР).
Ймовірна смерть: стан, коли піддослідна тварина вмирає або
очікується, що вона помре до наступного очікуваного моменту
спостереження. Ознаками такого стану для щурів є, наприклад, поява
конвульсій, перевертання набік, лежаче положення та тремтіння.
Додаткова інформація міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності
(9).
Напівлетальна доза: НД (коли гине 50% особин): статистично
50 взята повна доза хімічної речовини, в результаті дії якої
очікується летальний кінець у 50% тварин, які приймали хімікат
перорально. Показник НД виражається в одиницях ваги тестованої
50 речовини на вагу піддослідної тварини (мг/кг).
Допустима доза: допустима доза під час тестування (2000 або
5000 мг/кг).
Вмираючий стан: стан, коли тварина вмирає або не може вижити
навіть при наданні медичної допомоги. Додаткова інформація
міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності (9).
Очікувана смерть: наявність клінічних ознак, які вказують на
наближення летального результату у визначений час задовго до
запланованого часу завершення експерименту. Наприклад: тварина
нездатна дотягнутись до їжі або води. Додаткова інформація
міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності (9).
1.3. ПРИНЦИП ТЕСТУВАННЯ
В основі лежить поетапний метод застосування якомога меншої
кількості тварин на кожному етапі. Основним в методі є також
отримання достатньої кількості інформації щодо гострої токсичності
речовини для подальшої її класифікації. Групі тварин, залучених до
експерименту, перорально вводять хімічну речовину визначеної дози.
Речовину тестують поетапно: по три тварини однієї статі (як
правило, самки) на кожному з етапів. Наступний етап визначається
наявністю/відсутністю смертельного випадку через зазначену
речовину, наприклад:
- подальше тестування непотрібно,
- дозування ще трьох тварин однаковою дозою,
- подальше дозування ще трьох тварин більшою або меншою
дозою.
Деталі методу тестування описано в Додатку 1. За допомогою
цього методу можна провести оцінку класифікації тестованої
речовини стосовно однієї з серій токсичності, що визначається
фіксованими малозначними показниками НД .
50
1.4. ОПИС МЕТОДУ
1.4.1. Підбір видів тварин
Найкращим з виду гризунів є щур, хоча можна також
застосовувати інших представників цього виду. Як правило,
використовують самок (9), оскільки результати сучасних тестів НД
50
та спеціалізована література говорять про те, що, зазвичай, хоча
різниця між чутливістю статей невелика, проте, якщо такі
відмінності все ж спостерігаються, самки виявляються до певної
міри чутливішими (11). Однак, якщо в результаті вивчення
токсикологічних або токсикокінетичних властивостей структурно
зв'язаних хімічних речовин виявиться, що самці можуть бути
чутливішими, тоді перевага надається цій статі. Під час
використання в тестах самців необхідно обумовлювати доцільність їх
застосування.
Слід використовувати спеціально призначених для лабораторних
дослідів молодих здорових тварин. Важливо, щоб самки ще не
народжували та на момент тесту не чекали потомство. Вік кожної
тварини на момент прийняття дози повинен бути 8-12 тижнів, а вага
повинна падати з інтервалом +- 20% від середньої ваги будь-яких
попередньо дозованих тварин.
1.4.2. Умови утримування та годування тварин
Температура в експериментальних приміщеннях, де утримують
тварин повинна бути в межах 22 град.С (+- 3 град.С). Незважаючи на
те, що відносна вологість повинна бути, принаймні, 30% та, якщо
можливо, не перевищувати 70%, за винятком, коли приміщення
прибирають, необхідно намагатись, щоб цей показник був 50-60%.
Освітлення має бути штучним, з частотою 12 годин (світло-темно).
Що стосується сучасного годування тварин в лабораторних умовах, то
необхідно, щоб в їх раціоні кількість питної води не обмежувалась.
Тварин групують у клітках, згідно дозування, але важливо, щоб
кількість особин в одній клітці не заважала нормальному
спостереженню за кожною з них.
1.4.3. Підготовка тварин
Тварин обирають навмання, маркують для індивідуальної
ідентифікації та тримають в клітках не менше п'яти днів перед
початком дозування для того, щоб вони акліматизувались в
лабораторних умовах.
1.4.4. Підготовка доз
В загальному, об'єм дози повинен бути постійним відносно
інших видів доз, які застосовуватимуться в експерименті, але
відрізнятись концентрацією приготування. Коли тестують кінцевий
продукт рідини, то може виявитись, що застосування нерозбавленої
речовини, наприклад, при сталій концентрації, є важливішим в
процесі оцінки ризиків, які спричиняє така речовина, і така вимога
існує з боку деяких керівних органів. В будь-якому випадку
максимальний об'єм дози не можна збільшувати. Максимальний об'єм
дози, яку можна застосовувати один раз, залежить від розмірів
піддослідної тварини. Так, для щурів цей об'єм, як правило, на
повинен перевищувати 1 мл/100 г ваги тіла: проте, якщо
застосовуються водний розчин, тоді можна за основу взяти показник
ваги тіла в 2 мл/100 г. Що стосується самої рецептури приготування
дози, то, якщо можливо, рекомендується водний
розчин/суспензія/емульсія, які додаються в залежності від того, як
розчиняється суспензія/емульсія в олії (наприклад, кукурудзяній)
та інших технологічних рідинах. Коли використовуються інші
технологічні рідини (не вода), тоді необхідно ознайомитись з їх
характерними особливостями. Дози потрібно готувати безпосередньо
перед їх застосуванням, якщо невідома інформація щодо стабільності
приготування на певний період часу, протягом якого ці дози будуть
використані та вважатимуться придатними до застосування.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Застосування/введення доз
Введення дози відбувається методом штучного годування через
зонд або введенням трубки в орган. В окремих випадках, коли повну
дозу ввести не вдається, її розбивають на менші частини, на
період, який не перевищує 24 години.
Перед дозуванням тварин утримують від їжі наступним чином:
наприклад, щурам дають на ніч лише воду, мишам дають воду, а їсти
не дозволяють 3-4 години. Після такого утримання від їжі тварин
зважують, а потім вводять необхідну дозу хімічної речовини. Потім,
наступні 3-4 години щурів знову утримують від їжі, а мишей
1-2 години. Якщо дозування розбивається на частини, протягом
певного періоду, тварин за необхідності годують і дають воду, в
залежності від тривалості такого періоду дозування.
1.5.2. Кількість тварин та рівні дозування
На кожному етапі використовують трьох тварин. Початкова доза
для візуальної перевірки береться на основі рівнів фіксованої дози
в 5, 50, 300 та 2000 мг/кг. Це доза, від якої повинна наступати
смерть кількох тварин, яким цю дозу введено. Блок-схеми Додатку 1
описують процедуру, яку необхідно повторювати для кожної
початкової дози. Крім того, в Додатку 4 міститься інформація про
рекомендації щодо класифікації за Системою ЄС до тих пір, поки не
буде впроваджено нової ГГС.
Якщо є інформація про те, що смерть не може наступити при
найбільшому рівні дози (2000 мг/кг ваги тіла). У таких випадках
проводять граничний тест. Якщо немає інформації про тестовану
речовину, тоді з міркувань гуманного ставлення до тварин,
вводиться початкова доза 300 мг/кг ваги тіла.
Інтервал між дозуванням та початком надання медичної допомоги
групам залежить від початку появи ознак токсичності, тривалості та
критичності цих ознак, медичну допомогу тваринам не надають до тих
пір, поки не буде впевненості в тому, що вижили попередньо
дозовані тварини.
Лише в окремих випадках, і, якщо в цьому є потреба та
доцільність, дозволяється збільшувати рівень фіксованої дози до
5000 мг/кг (див. Додаток 2). З метою охорони тварин забороняється
тестування методом ГГС, Категорії 5, в межах доз 2000-5000 мг/кг.
Єдиним винятком може бути обґрунтована доцільність такого методу,
якщо є велика впевненість в тому, що результати тесту мають прямий
зв'язок з проблемами охорони навколишнього середовища та здоров'я
людини.
1.5.3. Граничний тест
Граничний тест головним чином застосовують в ситуаціях, коли
в експериментатора є інформація про те, що тестований матеріал
очевидно виявиться нетоксичним, тобто, матиме показник токсичності
в межах допустимих норм. Інформацію стосовно токсичності матеріалу
можна отримати з даних про тестування подібних хімічних речовин,
сумішей або продуктів, враховуючи також характеристику та
процентне співвідношення компонентів, що можуть виявитись
токсичними. У подібних ситуаціях, коли майже немає інформації про
токсичність або, якщо очікується така токсичність застосованого
матеріалу, необхідно проводити повне тестування (основний тест).
Граничний тест із застосуванням дози 2000 мг/кг ваги тіла
може проводитись на шести тваринах (по три тварини на етап). В
окремих випадках граничний тест проводять на трьох тваринах із
застосуванням дози 5000 мг/кг (див. Додаток 2). Якщо в результаті
застосування речовини настає летальний кінець, може виявитись
необхідним провести подальше тестування із застосуванням меншої
дози.
1.6. СПОСТЕРЕЖЕННЯ
Тварин спостерігають індивідуально після дозування, хоча б
раз протягом перших 30 хвилин, періодично протягом 24 годин,
особливо на перші чотири години. Потім спостерігають щодня,
протягом 14 днів, крім ситуацій, коли експеримент припиняють, а
тварин позбавляють життя з міркувань гуманності, або, якщо тварин
знайдено вже мертвими. Проте, тривалість експерименту непотрібно
суворо ставити в певні часові рамки. Тривалість повинна
обумовлюватись токсичними реакціями, початком та тривалістю
відновлювального періоду та може при потребі розтягуватись. Дуже
важливим є зафіксувати, коли з'являються та зникають ознаки
токсичності, особливо, якщо є тенденція запізнілої появи таких
ознак (12). Результати спостережень систематично записують,
затверджуючи їх окремо стосовно кожній тварині.
Додаткові спостереження необхідно проводити, якщо тварини
продовжують проявляти ознаки токсичності. У процесі спостережень
потрібно виявити зміни на шкірі, шерсті, очах, слизовій оболонці,
а також в дихальній системі, системі кровообігу, вегетативній та
центральній нервовій системі. Також спостерігаються зміни в
соматомоторній діяльності та поведінці. Необхідно уважно
слідкувати за тим, чи з'являються тремтіння та конвульсії,
виділення слини, діарея, впадання в летаргійний сон та кому.
Керуватись необхідно критеріями, поданими в Рекомендаціях щодо
Гуманності (9). Тварин, що помирають або страждають від сильного
болю та нездужання, необхідно позбавляти життя гуманним способом.
Якщо тварин позбавлено життя з гуманних міркувань або знайдено вже
мертвими, необхідно обов'язково якомога точніше вказати час
смерті.
1.6.1. Вага тіла
Вагу тіла тварин необхідно визначити незадовго до початку
дозування, а також через тиждень після цього. Будь-які зміни у
вазі потрібно вираховувати та записувати. Тварин, які вижили, в
кінці експерименту зважують, а потім гуманно позбавляють життя.
1.6.2. Патологія
Всім тваринам (навіть тим, які померли під час тесту або були
усунуті від подальшого експерименту з гуманних міркувань) роблять
загальний розтин. Результати загальних патологічних змін записують
окремо стосовно кожної тварини. До уваги беруться і результати
мікроскопічного дослідження органів, в яких виявлено ознаки
загальної патології. Йдеться про тварин, які вижили через 24 або
більше годин після першого дозування. Такі результати можуть
виявитись досить важливими.
2. ДАНІ
Подаються дані окремо про кожну тварину. Крім того, всю
інформацію підсумовують у вигляді таблиці, вказуючи кількість
тварин кожної тестованої групи, кількість тварин, в яких виявлено
ознаки токсичності, кількість померлих в ході експерименту або
позбавлених життя з гуманних міркувань. Фіксується також час
смерті окремих тварин, опис та час появи ознак токсичності та
зворотного процесу, а також результати розтину.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. Звітність про результати тесту
Повідомлення результатів тесту повинно включати наступну
інформацію:
Тестована речовина:
- характерні особливості, наявність домішок і, якщо
необхідно, фізико-хімічні властивості (включаючи ізомеризацію),
- дані про ідентифікацію та номер CAS.
Технологічна рідина (якщо є доцільність):
- необхідність вибору рідини (якщо це не вода).
Піддослідні тварини:
- вид/рід тварин,
- мікробіологічний статус тварин, якщо відомо,
- кількість, вік та стать тварин (включаючи, якщо потрібно,
обґрунтування вибору самців замість самок),
- інформація про те, звідки тварини, умови утримування, корм
тощо.
Умови проведення тесту:
- інформація щодо рецептури/складу речовини, включаючи деталі
фізичної форми застосовуваного матеріалу,
- деталі застосування тестованої речовини, включаючи дані про
об'єми та час дозувань,
- інформація про якість їжі та води (також, тип
раціону/корму, походження, походженні води),
- обґрунтування вибору початкової дози.
Результати:
- результати щодо отриманої інформації та рівень дози для
кожної тварини (наприклад, тварини з ознаками токсичності; також
дані про смертність, особливості, труднощі та тривалість ефектів,
- введення в таблицю даних про вагу та зміни у вазі,
- індивідуальна вага тварин в день дозування, з тижневими
інтервалами, та в момент смерті або під час настання конвульсій та
страждань,
- дата й час смерті, якщо остання наступила перед початком
страждань тварини,
- початок і період тривалості токсичних ознак, і чи не має це
зворотної дії на кожну з тварин,
- результати загального та гістопатологічного розтину окремо
стосовно кожної тварини, якщо такі результати є.
Обговорення та інтерпретація результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D (1986) New
Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol.
Lett., Suppl. 31, p. 86.
(2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D (1989)
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien.
Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336-341.
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E
(1994) The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method
(Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559-610.
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1995)
The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729-734.
(5) Diener W., and Schlede E., (1999) Acute Toxicity Class
Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16,p. 129-134.
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D., (1992). A
National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method - An
Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D., (1994)
The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method
(Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659-670.
(8) OECD, (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity
Testing. Environmental Health and SafetyMonograph Series on
Testing and Assessment No 24. Paris.
(9) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition,
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment
No 19.
(10) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998,
Part 2, p. 11 (http:// webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/
displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html).
(11) Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D.,
Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer
J.A. and Myers R.C. (1995) Comparison of the Up-and Down,
Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd.
Chem. Toxicol 33, p. 223-231.
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute
Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods ow Toxicology.
Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York,
USA.

Додаток 1

НЕОБХІДНА ПРОЦЕДУРА СТОСОВНО КОЖНОЇ ПОЧАТКОВОЇ ДОЗИ

ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ
Для кожної початкової дози є схеми тестування (як вказано в
даному Додатку), які описують подальшу процедуру.
- Додаток 1а: початкова доза: 5 мг/кг на вагу тіла,
- Додаток 1б: початкова доза: 50 мг/кг на вагу тіла,
- Додаток 1в: початкова доза: 300 мг/кг на вагу тіла,
- Додаток 1г: початкова доза: 2000 мг/кг на вагу тіла
Нижчеподані стрілки вказують на те, як відбувається
процедура, в залежності від кількості померлих або гуманно
позбавлених життя тварин.
Додаток 1А
( 994_b14 )

Додаток 1В
( 994_b14 )

Додаток 1С
( 994_b14 )

Додаток 1D
( 994_b14 )

Додаток 2

КРИТЕРІЇ КЛАСИФІКАЦІЇ ТЕСТОВАНИХ РЕЧОВИН
З ОЧІКУВАНИМИ ПОКАЗНИКАМИ НД БІЛЬШЕ 2000 МГ/КГ
50
БЕЗ НЕОБХІДНОСТІ ТЕСТУВАННЯ

Критерії небезпеки Категорії 5 необхідні для того, щоб можна
було ідентифікувати тестовані речовини, рівень токсичності яких
досить низький, але які за певних обставин можуть становити
небезпеку вразливим групам людей. Очікувані показники НД при
50 пероральному або шкірному подразненні становитимуть
2000-5000 мг/кг або відповідатимуть еквівалентним дозам інших
напрямків тестувань. Тестовані речовини можна було б класифікувати
згідно категорії небезпеки так: 2000 мг/кг < НД < 5000 мг/кг
50 (Категорія 5 в ГГС). Класифікація можлива в наступних випадках:
(а) якщо на таку категорію вказують схеми тестування
Додаток 1а-1г базуючись на летальних випадках,
(b) якщо є достатньо доказів того, що НД знаходиться в
50
межах показників Категорії 5; або, якщо дослідження інших
токсичних ефектів в тварин вказують на те, що можлива реальна
велика загроза життю людини;
(c) методом екстраполяції, оцінки або вимірювання даних, якщо
не підтверджується зарахування речовини до класу більш загрозливих
хімікатів, а також
- коли є достовірна інформація про те, що було виявлено
гострі токсичні ознаки у людей або
- мав місце летальний кінець під час тестування шляхом
перорального введення, відповідно до показників Категорії 4, чи
- у разі експертного підтвердження того, що з'явились ознаки
токсичності під час тестування, відповідно до показників
Категорії 4, за винятком тестів на вияв діареї, пілоерекції або
інших невизначених ознак, або
- якщо в разі експертного підтвердження виявиться, що можливі
гострі ознаки токсичності, отримані в ході інших експериментів над
тваринами.
ТЕСТУВАННЯ ДОЗАМИ, ЩО ПЕРЕВИЩУЮТЬ 2000 МГ/КГ
З метою охорони тварин та гуманного ставлення до них
забороняється тестування тварин за Категорією 5 (5000 мг/кг), і
дозволяється лише в тих випадках, коли є велика ймовірність того,
що отримані результати можуть бути безпосередньо пов'язані з
охороною здоров'я людини та захистом тварин (10). Подальше
тестування із застосуванням більших доз непотрібно.
Якщо тестування є необхідним, тоді потрібно виконувати лише
один його етап з дозою 5000 мг/кг. У випадку, якщо перша тварина
помирає в ході експерименту, подальше тестування проходить з
використанням дози 2000 мг/кг, як показано в блок-схемах
Додатку 1. І, навпаки, коли тварина виживає, дозують двох
наступних. Якщо вмирає тільки одна з трьох тварин, є ймовірність
того, що показник НД може бути більшим за 5000 мг/кг. Коли
50 вмирають обидві тварини, дозування продовжують з 2000 мг/кг.

Додаток 3
( 994_b14 )

В.2. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ (ВДИХАННЯ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Бажано мати попередню інформацію про гранулометричний склад
речовини, тиск пари, температуру плавлення, температуру кипіння,
загорання та вибуху (якщо є).
Див. також Вступ до Частини В (А).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Див. Вступ до Частини В (В).
1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Декілька груп з піддослідними тваринами піддають дії хімічної
речовини в різних концентраціях - по одній на групу. Потім
спостерігають вплив речовини та пов'язані з цим летальні випадки.
Померлим під час тесту тваринам роблять розтин, і після закінчення
експерименту тваринам, що вижили, також роблять розтин.
Тварин, що виявляють гострі ознаки нездужання та болю, за
необхідності, позбавляють життя гуманним способом. Не дозволяється
застосовувати такі дози хімічних речовин, в результаті роз'їдаючої
або подразливої дії яких виникає сильний біль чи нездужання.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Підготовка
Необхідно, щоб не менше п'яти днів до початку експерименту
тварини перебували в спеціальних умовах утримання та годування. До
початку тестування тварини навмання вибирають та розподіляють на
певну кількість груп. Моделювання ситуації, коли тварин піддають
дії препарату, непотрібно, якщо це не передбачено приладом, який
застосовуватиметься при тестуванні.
Сухі тверді речовини при потребі подрібнюють, щоб
гранулометричні зразки були відповідного розміру.
Якщо необхідно отримати відповідну концентрацію речовини в
атмосфері, дозволяється додавати необхідну технологічну рідину та
використовувати апаратний контроль за рідиною. У випадку, якщо
застосовуються добавки або інші технологічні рідини, необхідно
отримати про них необхідну інформацію, щоб не викликати токсичних
ефектів. Можна використовувати дані за минулі періоди.
1.6.2. Умови тестування
1.6.2.1. Тварини в ході експерименту
Перевага віддається щурам, якщо немає інших вказівок. При
цьому застосовуються спеціальні лабораторні види тварин. На момент
проведення тесту необхідно, щоб вага тварин кожної статі не
перевищувала +- 20% середнього показника.
1.6.2.2. Кількість та стать тварин
Для кожного рівня концентрації використовують не менше
10 гризунів (по п'ять особин кожної статі). Важливо, щоб самки до
того ще не народжували та на момент тесту не чекали потомство.
Примітка: в тестах для визначення гострої токсичності, який
піддаються тварини вищого від гризунів виду, кількість тварин
повинна бути меншою. Дозування при цьому ретельно розподіляють
так, щоб не перевищити середню дозу токсичності. Під час
проведення таких тестів слід уникати доз, в результаті дії яких
може настати летальний кінець.
1.6.2.3. Концентрації доз
Їх повинна бути достатня кількість - не менше трьох, з таким
інтервалом, щоб можна було виявити ознаки токсичності в тварин та
показники смертності. Такої інформації повинно бути достатньо для
того, щоб побудувати криву концентрації смертності, і, якщо є
можливість, визначити НД . 1.6.2.4. Граничного тесту.
50
1.6.2.4. Граничний тест
Якщо в результаті тестування п'яти самок та п'яти самців з
використанням 20 мг/л газу або 5 доріжок/л аерозолю або порошку
протягом 4 годин (або, якщо таке неможливо через фізико-хімічні та
вибухові властивості речовини, максимально можливої концентрації)
не буде виявлено суміші, від якої наступає смерть протягом
14 днів, - подальше тестування вважається непотрібним (18 АТР,
рішення ЄЕС 93/21, L 110/93).
1.6.2.5. Тривалість дії
Тривалість дії - 4 години.
1.6.2.6. Обладнання
Тестування тварин проводять із застосуванням інгаляційного
обладнання, яке розроблено таким чином, щоб підтримувати
динамічний потік повітря з 12 повітряних обмінів на годину для
того, щоб був рівномірний розподіл кисню при рівномірному впливі
атмосфери. Якщо дослід проводять в камері, необхідно, щоб її
конструкція була такою, щоб мінімізувати скупчення тварин, і
надати їм якомога більше можливості вдихнути хімічну речовину. Для
того, щоб була певна стабільність всередині камери, необхідно, як
правило, щоб загальний "об'єм" тварин не перевищував 5% від об'єму
самої камери. Використовуються камери для фіксації ротової та
носової області тварини або лише голови, або ж застосовують окремі
камери для того, щоб тварина могла там розміститись повністю;
перші два види камери можуть мінімізувати ризик проходження
хімікату іншими шляхами.
1.6.2.7. Період спостереження
Період спостереження повинен тривати не менше 14 днів. Проте,
обмежувати в часі період спостереження непотрібно. Він
визначатиметься токсичними реакціями, швидкістю появи ознак
токсичності та періодом відновлення; при потребі цей період часу
очікування збільшують. Важливим є спостереження за тим, коли саме
з'являються/зникають ознаки токсичності, яка їх тривалість в часі,
а також, коли настає летальний кінець, особливо, якщо
спостерігається тенденція затримки смерті.
1.6.3. Процедура
Перед початком експерименту тварин зважують, а потім піддають
впливу концентрації речовини в призначеному для цього пристрої
протягом 4 годин, після врівноваження з концентрацією камери. Час
врівноваження повинен бути коротким. Температура проведення тесту
встановлюється на рівні 22 +- 3 град.С. Бажано, щоб відносна
вологість повітря становила 30%-70%, а в окремих випадках
(наприклад, тестування аерозолів) таких вимог не дотримуються.
Якщо всередині камери встановити невеликий від'ємний тиск
(>= 5 мм води), тоді це допоможе запобігти витіканню речовини
назовні. Під час експерименту тваринам не дають води та їжі.
Необхідно використовувати відповідні системи для створення та
моніторингу навколишньої атмосфери в експерименті. Система має
забезпечити стійкі стабільні умови проведення тесту якомога
швидше. Конструкція камери повинна бути такою, щоб розподілення в
ній речовини було рівномірним.
У ході моніторингу проводять наступні вимірювання:
(а) швидкість повітряного потоку (постійно);
(b) фактична концентрація тестованої речовини, взятої в зоні
дихання не менше трьох разів під час експерименту (деякі
атмосфери, наприклад, аерозолі високої концентрації можуть не
потребувати такого частого моніторингу). У ході експерименту
рівень концентрації речовини не повинен коливатись більше, ніж на
+- 15% від середнього показника. Проте, для деяких аерозолів цього
рівня контролю отримати не вдається, і дозволяється коливання
концентрації речовини в більших межах. Для аерозолів проводять
аналіз розміру часток стільки разів, скільки необхідно (не менше
одного разу в одній групі тесту);
(c) температура та вологість, якщо можливо - постійно.
Під час проведення експерименту необхідно систематично
записувати спостереження. Роблять окремі записи стосовно кожної
тварини. У перший день експерименту спостереження проводять досить
часто. Необхідно, принаймні, кожного робочого дня робити ретельний
клінічний огляд, а також проводити інші спостереження щодня, щоб
мінімізувати втрати тварин в ході експерименту (наприклад, розтин
або замороження тварин, знайдених вже мертвими, ізоляція слабких,
напівмертвих тварин, а також тих, які зазнають сильного болю).
Під час спостережень потрібно виявляти зміни на шкірі,
шерсті, очах, слизовій оболонці, а також в дихальній системі,
системі кровообігу, вегетативній та центральній нервовій системі.
Також спостерігаються зміни в соматомоторній діяльності та
поведінці. Необхідно уважно слідкувати за тим, чи з'являються
тремтіння та конвульсії, виділення слини, діарея, впадання в
летаргічний сон та кому. Необхідно якомога точніше записати час
смерті. Індивідуальну вагу тварин визначають потижнево після
експерименту та на момент смерті.
Тварини, які померли в ході тесту, а також ті, які вижили
після закінчення експерименту, піддаються розтину. Особливу увагу
звертають на зміни у верхніх та нижніх дихальних шляхах. Всі
загальні патологічні зміни також записують. В окремих випадках
беруть зразки тканин для гістопатологічного дослідження.
2. ДАНІ
Всі дані підсумовують у вигляді таблиці, в якій стосовно
кожної групи вказують наступне: кількість тварин на початку тесту,
час смерті окремих тварин, кількість тих тварин, в яких виявлено
інші ознаки токсичності, опис токсичних ефектів та результати
розтину. Якщо виживання тварини перевищує норму одного дня,
необхідно вирахувати та записати зміни у вазі. Результати щодо
тварин, яких було гуманним способом позбавлено життя, через
виявлення в них ознак недомагання сильного болю чи нездужання,
записуються, як летальні випадки, причиною яких став гострий біль
від приймання хімікату. Показник НД визначається відповідним для
50 цього методом. Оцінка даних повинна включати співвідношення (якщо
такі мають місце) між дією речовини на тварину та ступенем
важкості отриманих в результаті цього відхилень. Сюди входять
аномалії поведінки, клінічні відхилення, загальні ураження, зміни
у вазі, смертність та інші токсичні ефекти.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ТЕСТУВАННЯ
Звітність про результати тестування, якщо можливо, включати
повинна містити наступну інформацію:
- біологічний вид та походження тварин, умови утримання,
середовище та харчування тощо,
- умови проведення тестування: опис приладу, де було
проведено експеримент, конструкція, тип, розміри, система
надходження повітря, система генерації аерозолів, метод
кондиціювання повітря, утримання тварин в тестовій камері, якщо
така використовується.
Дані результатів експерименту
Подаються в таблиці з середніми показниками та показником
можливого відхилення (наприклад, стандартне відхилення) і містять,
якщо можливо, наступне:
(а) швидкість повітряного потоку через інгаляційний пристрій;
(b) температура та вологість повітря;
(c) номінальні концентрації (загальна кількість тестованої
речовини, введеної в інгаляційний пристрій, поділена на об'єм
повітря);
(d) особливості технологічної рідини, якщо така
застосовується;
(e) фактичні концентрації в дихальній зоні тесту;
(f) Мас-медіанний аеродинамічний діаметр (ММАД) та
Геометричне стандартне відхилення (ГСВ);
(g) період врівноваження;
(h) час впливу (дії речовини на об'єкт тестування);
- зведення в таблиці отриманих даних про вплив на кожну стать
(наприклад, кількість тварин, які померли або були гуманно
позбавлені життя, кількість тварин з ознаками токсичності,
кількість тварин в ході експерименту),
- час смерті під час експерименту, причини та критерії для
позбавлення тварин життя гуманним способом,
- всі інші спостереження,
- показник НД щодо кожної статі - визначається в кінці
50 періоду спостереження (визначеним методом розрахунків),
- 95% інтервал довіри для НД (там, де можна отримати такі
50 дані),
- крива дозування/смертності, падіння (якщо дозволяє метод
визначення),
- результати розтину,
- будь-які гістопатологічні результати,
- обговорення результатів (звернути особливу увагу на те,
який вплив на показник НД має гуманне позбавлення тварин життя),
50
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРИТАЦІЯ
Див. Вступ до Частини В (D).
4. ПОСИЛАННЯ
Див. Вступ до Частини В (D).

В.3. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ (УРАЖЕННЯ ШКІРИ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Див. Вступ до Частини В (А).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Див. Вступ до Частини В (В).
1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Тестована речовина вводиться в шкіру вибраними дозами кільком
групам піддослідних тварин, по одній дозі на групу. Далі
спостерігають ефекти цього дозування та випадки смертності.
Тварин, які в ході експерименту помирають, віддають на розтин, а
тих, які вижили після закінчення тесту, також розтинають.
Тварин, які мають явно виражене наростання болю та сильно
страждають, необхідно позбавити життя гуманно. Не потрібно
застосовувати такі дози хімічних речовин, які спричиняють різкий
сильний біль та нездужання через свою роз'їдаючу корозійну
властивість.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.6.1. Підготовка
Протягом п'яти днів до початку експерименту тварин розміщують
у дослідних клітках, з відповідними умовами утримання та
годування. Перед тестом вибирають навмання молодих та здорових
тварин та групують. Приблизно за 24 години до тесту необхідно
видалити шерсть, вирізавши або поголивши ділянку від спини до
голови тварини. Важливо це робити обережно, щоб в ході такої
процедури не пошкодилась шкіра тварин, оскільки її ураження може
вплинути потім на проникність хімічної речовини. Так, необхідно,
щоб 10% тіла тварини було чистим від шерсті, для введення
хімікату. У випадку використання сухих твердих хімічних речовин
можна застосовувати пульверизатор, а саму речовину потрібно
змочити в достатній кількості води або, при потребі, в іншому
технологічному розчині для кращого приставання до шкіри. Коли
використовується технологічна рідина, необхідно врахувати її вплив
на властивість шкіри пропускати хімікат. Як правило, рідини в ході
тестування використовують нерозбавленими.
1.6.2. Умови проведення тесту
1.6.2.1. Тварини для експерименту
Беруть дорослого щура або кролика. Якщо доцільно, тоді можна
використовувати тварин інших видів. Зазвичай беруть лабораторних
тварин. Що стосується ваги, то на момент експерименту, вага особин
кожної статі може коливатись від межах +- 20% відносно певного
середнього показника.
1.6.2.2. Стать та кількість тварин
Використовується не менше п'яти тварин однієї статі на
кожному етапі дозування. Якщо використовуються самки, важливо, щоб
вони ще не народжували та на момент тесту не чекали потомство.
Також, якщо є інформація про те, що одна стать є чутливішою, ніж
інша, тоді варто дозувати представників саме цієї статі.
Примітка: в тестах на визначення гострої токсичності, де
задіяні тварини вищого від гризунів виду, кількість тварин повинна
бути меншою. Дозування при цьому ретельно розподіляють так, щоб не
перевищити середню дозу токсичності. Під час проведення таких
тестів слід уникати доз, в результаті дії яких може настати
летальний кінець.
1.6.2.3. Концентрації дозувань
Їх повинна бути достатня кількість - не менше трьох, з таким
інтервалом, щоб можна було виявити ознаки токсичності в тварин та
показники смертності. При фасуванні дози враховують роз'їдаючі та
корозійні властивості самої речовини. Такої інформації повинно
бути достатньо для того, щоб побудувати криву дозування та
отриманих результатів, і, якщо є можливість, - визначити НД .
50
1.6.2.4. Граничний тест
Використовуючи вищеописані процедури можна провести
експеримент із застосуванням дози рівня 2000 мг/кг на вагу тіла на
прикладі групи з п'яти тварин, як самок, так і самців. Варіант
повного тесту не розглядатиметься, якщо результатом такого
експерименту буде смерть, що наступила внаслідок приймання
зазначеного хімікату.
1.6.2.5. Період спостереження
Період спостереження повинен тривати не менше 14 днів. Проте,
обмежувати в часі період спостереження непотрібно. Він
визначатиметься токсичними реакціями, швидкістю появи ознак
токсичності та періодом відновлення; при потребі цей період часу
очікування збільшують. Важливим є спостереження за тим, коли саме
з'являються/зникають ознаки токсичності, яка їх тривалість в часі,
а також, коли настає летальний кінець, особливо, якщо
спостерігається тенденція затримки смерті.
1.6.3. Процедура
Тварин розміщують в клітках окремо. Хімічну речовину
розподіляють рівномірно, охоплюючи приблизно 10% загальної
поверхні тіла тварини. Якщо використовуються хімікати високої
токсичності, тоді загальна поверхня тіла тварини, вкрита такою
речовиною, може бути меншою, але так, щоб ця речовина
розподілялась рівномірним тонким шаром.
Протягом періоду усіх 24 годин хімічні речовини при контакті
з шкірою повинні бути в марлевій сітці з не подразнюючою клейкою
тасьмою. Місце проведення тесту також потім відповідно накривають,
щоб речовина з сітки не просочилась, і тварини не могли її
проковтнути. Утримуючі пристрої необхідні для того, щоб тварина не
проковтнула хімікат, але повна фіксація не рекомендується.
Наприкінці експерименту видаляють рештки речовини, і, якщо
необхідно, промивають шкіру водою або чимось іншим.
Під час проведення експерименту необхідно систематично
записувати проведення спостережень. Роблять окремі записи про
кожну тварину. У перший день експерименту спостереження проводять
досить часто. Необхідно, принаймні, кожного робочого дня робити
ретельний клінічний огляд, а також проводити інші спостереження
щодня, щоб мінімізувати втрати тварин в ході експерименту
(наприклад, розтин або замороження тварин, знайдених вже мертвими,
ізоляція слабких, напівмертвих тварин, а також тих, які зазнають
сильного болю).
У процесі спостережень потрібно виявити зміни на шкірі,
шерсті, очах, слизовій оболонці, а також в дихальній системі,
системі кровообігу, вегетативній та центральній нервовій системі.
Також спостерігаються зміни в соматомоторній діяльності та
поведінці. Необхідно уважно слідкувати за тим, чи з'являються
тремтіння та конвульсії, виділення слини, діарея, впадання в
летаргічний сон та кому. Необхідно якомога точніше записати час
смерті. Індивідуальну вагу тварин визначають щотижнево після
експерименту та на момент смерті. Тварини, які померли в ході
тесту, а також і ті, які вижили після закінчення експерименту,
піддаються розтину. Особливу увагу звертають на зміни у верхніх та
нижніх дихальних шляхах. Всі загальні патологічні зміни також
записують. В окремих випадках беруть зразки тканин для
гістопатологічного дослідження.
Оцінка токсичності в представників протилежної статі
Після того, як закінчено тестування однієї статі, дозують
хоча б одну групу з п'яти тварин протилежної статі, щоб визначити,
чи ці тварини не є більш чутливими до хімічної речовини. В окремих
випадках може бути доцільним тестувати й меншу кількість тварин.
Якщо є достовірна інформація про те, що тварини тієї статі, над
якою проводились експерименти, є більш чутливими до взятої
хімічної речовини, тоді проведення подальшого тестування можна
уникнути.
2. ДАНІ
Всі дані підсумовують у вигляді таблиці, в якій про кожну
групу вказують наступне: кількість тварин на початку тесту, час
смерті окремих тварин, кількість тих тварин, у яких виявлено інші
ознаки токсичності, опис токсичних ефектів та результати розтину.
Якщо виживання тварини перевищує одноденну норму, необхідно
вирахувати та записати зміни у вазі. Результати, що стосуються
тварин, яких було гуманним способом позбавлено життя, через
виявлення в них ознак гострого болю та нездужання, записуються, як
летальні випадки, причиною яких стали гострий біль від приймання
хімікату. Показник НД визначається відповідним для цього
50 методом.
Оцінка даних повинна включати співвідношення (якщо такі мають
місце) між дією речовини на тварину та ступенем тяжкості отриманих
у результаті цього відхилень. Сюди входять аномалії поведінки,
клінічні відхилення, загальні ураження, зміни у вазі, смертність
та інші токсичні ефекти.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ТЕСТУ
Звітність про результати тесту, якщо можливо, повинна містити
наступну інформацію:
- біологічний вид та походження тварин, умови утримання,
середовище та харчування тощо,
- умови проведення тестування (включаючи метод очищення шкіри
від шерсті та обробка камери: з накриттям чи без),
- час смерті під час або протягом експерименту, причини та
критерії для позбавлення тварин життя гуманним способом,
- рівні дозувань (з використанням технологічної рідини,
концентрації),
- стать дозованих тварин,
- введення в таблицю отриманих даних про кожну стать, рівень
дози (наприклад, кількість померлих/позбавлених життя тварин в
ході тесту, кількість тварин з ознаками токсичності, загальна
кількість протестованих тварин),
- час настання смерті після дозування, причини та критерії
для гуманного позбавлення життя,
- всі інші спостереження,
- показник НД стосовно кожній статі - визначається на
50 14 день спостереження (визначеним методом розрахунків),
- 95% інтервал довіри для НД (там, де можна отримати такі
50 дані),
- крива дозування/смертності, падіння (якщо дозволяє метод
визначення),
- результати розтину,
- будь-які гістопатологічні результати,
- результати будь-якого тесту стосовно протилежній статі,
- обговорення результатів (звернути особливу увагу на те,
який вплив на показник НД матиме гуманне позбавлення тварин
50 життя),
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРИТАЦІЯ
Див. Вступ до Частини В (D).
4. ПОСИЛАННЯ
Див. Вступ до Частини В (Е).

В.4. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ: УРАЖЕННЯ/РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ
1. МЕТОД
Даний метод є еквівалентним ТІ (Тестовим інструкціям) ОЕСР
404 (2002).
1.1. ВСТУП
Під час підготовки та розробки цього вдосконаленого методу
особливу увагу приділяли питанням модернізації охорони тварин,
оцінці існуючої інформації про хімічну речовину, з метою можливого
уникнення потреби проведення лабораторних дослідів на тваринах.
Даним методом рекомендується аналізувати фактичну вагу тварин на
підставі існуючої відповідної інформації перед самим проведенням
дослідження на живих істотах (тести на роз'їдання та ураження
шкіри). Якщо для такої оцінки немає достатньо даних, тоді їх можна
отримати з наступного тесту (1). Стратегія тестування включає
виконання дійсних та загальноприйнятих тестів у пробірці, і
подається, як Додаток до даного методу. Крім того, в ході
початкового тесту в пробірці рекомендується поступове, а не
одночасне, застосовування до тварини трьох тестових зразків.
З метою дотримання правил охорони тварин та розумного
наукового підходу необхідно утриматись від проведення тестів на
живих організмах до тих пір, поки не буде оцінено дію хімічної
речовини (роз'їдання/ураження шкіри) методом аналізу фактичної
ваги. До таких даних входять лабораторні дослідження на людях
та/або тваринах, докази роз'їдання речовиною або кількома
структурно подібними речовинами або сумішами таких речовин, дані,
що показують високу кислотність або лужність речовини (2)(3), а
також результати дійсних загальноприйнятих тестів на живих
організмах (коли доза вводиться спочатку в ізольовані клітини, а
потім в організм) та в пробірці (4)(5)(5а). Такий метод аналізу
повинен зменшити потребу в проведені тесту на живих істотах на
предмет виявлення роз'їдання/ураження шкіри хімікатами, про дію
яких вже є достатньо інформації з інших тестів.
Перевага надається стратегії послідовного тестування, яка
полягає в проведенні експериментів в пробірці або колишніх
досліджень на живих організмах на предмет роз'їдання/ураження
шкіри. Дана стратегія подається, як Додаток до цього Методу. Така
стратегія була розроблена, одностайно рекомендована учасниками
семінару ОЕСР (6) та прийнята, як рекомендована стратегія
тестування Глобальної Гармонізованої Системи (ГГС) класифікації
хімічних речовин (7). Дану стратегію рекомендується застосовувати
перед виконанням дослідів на живих організмах. Що стосується
істотно нових хімічних речовин, то рекомендується поступовий
підхід до тестування для розробки науково обґрунтованих даних щодо
ураження/роз'їдання речовиною поверхні об'єкта експерименту. Якщо
йдеться про вже існуючі речовини, про які немає достатньо
інформації щодо ефекту ураження/роз'їдання, тоді описана стратегія
повинна заповнити такі прогалини. Можливе впровадження іншої
методики або стратегії, а також прийняття рішення щодо відмови
застосування поступового підходу. Проте, необхідно обґрунтувати
доцільність таких рішень.
Якщо не вдається визначити корозійну активність або ефект
ураження/подразнення за допомогою аналізу фактичної ваги,
сумісного зі стратегією поступового тестування, необхідно
розглянути можливість тестування на живих організмах протягом
4 годин.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Ураження/подразнення шкіри: завдання шкірі оборотної шкоди
після застосування тестованої речовини протягом 4 годин.
Роз'їдання шкіри: завдання шкірі необоротної шкоди; тобто,
візуально спостерігається омертвіння епідерму шкіри, після
застосування тестованої речовини протягом 4 годин. Типовими
ознаками реакції роз'їдання є виразки, кровотечі, криваві струпи,
і наприкінці 14-го дня експерименту відбувається зміна кольору
через відбілювання шкіри, спостерігаються великі ділянки облисіння
та шрами. Деякі ураження викликають спірні запитання, тому
рекомендується гістопатологія.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Хімічну речовину, що є предметом тестування, наносять однією
дозою на шкіру піддослідної тварини; неуражені ділянки шкіри
якості слугують для порівняння. Показник рівня роз'їдання шкіри
зчитується та записується через певні інтервали, і описується далі
для того, щоб забезпечити повну оцінку отриманих результатів.
Дослідження повинно тривати стільки, щоб оцінити можливість
оборотності/необоротності отриманих ефектів.
Тварин, які виявляють ознаки тривалих страждань та гострого
болю на будь-якому з етапів тестування, необхідно позбавити життя
гуманним способом. Критерії прийняття рішень щодо гуманності
позбавлення життя тварин, які знаходяться в передсмертному стані,
можна знайти в посиланні (8).
1.4. ОПИС МЕТОДУ
1.4.1. Підготовка до проведення тесту на живих організмах
1.4.1.1. Вибір виду тварин
В якості найкращої лабораторної тварини підходить
кролик-альбінос та молоді дорослі кролі загалом. Доцільність
використання інших видів тварин повинна бути відповідно
обґрунтована.
1.4.1.2. Підготовка тварин
Приблизно за 24 години до початку тесту необхідно видалити
шерсть, вирізавши шерсть або поголивши ділянку від спини до голови
тварини. Важливо це робити обережно, щоб в ході такої процедури не
пошкодилась шкіра тварин, тому варто вибирати лише тварин зі
здоровою, неушкодженою шкірою.
1.4.1.3. Умови утримання та годування
Тварин необхідно тримати окремо. Температура в
експериментальних приміщеннях, де утримують кролів повинна бути в
межах 22 град.С (+- 3 град.С). Незважаючи на те, що відносна
вологість повітря повинна бути, принаймні, 30% та, якщо можливо,
не перевищувати 70%, за винятком, коли приміщення прибирають,
необхідно намагатись, щоб цей показник був 50-60%. Освітлення має
бути штучним, з інтервалом 12 годин (світло-темно). Що стосується
сучасного годування тварин в лабораторних умовах, то необхідно,
щоб в їх раціоні кількість питної води не обмежувалась.
1.4.2 Процедура тесту
1.4.2.1. Застосування/нанесення тестованої речовини
Тестовану речовину наносять на невелику ділянку шкіри
(приблизно, 6 кв.см) і накривають клаптиком марлі, яку
прикріплюють до тіла тварини клейкою тасьмою, яка б не спричиняла
подразнення. Якщо в деяких випадках пряме нанесення речовини
неможливе (наприклад, рідини або пастоподібні речовини), тоді
хімікат спочатку наносять на марлю, яку в свою чергу прикріплюють
на шкіру тварини. Марля з речовиною повинна бути вільно
прикріплена до шкіри за допомогою напівгерметичної пов'язки на
весь період експерименту. Якщо речовина наноситься на марлю, а
потім на шкіру, то закріплюватись вона повинна так, щоб був
хороший контакт та рівномірний розподіл хімікату по всій поверхні
шкіри. Необхідно, щоб тварина не змогла дістати марлю з речовиною,
а також з'їсти або вдихнути її.
Рідини, в основному, застосовують в нерозбавленому виді. У
випадку використання сухих твердих хімічних речовин (за потреби
можна застосовувати пульверизатор) саму речовину потрібно змочити
в достатній кількості води або, при потребі, в іншому
технологічному розчині для кращого приставання до шкіри. Коли
використовується технологічна рідина (не вода) необхідно, щоб
можливий вплив хімікату на шкіру, її роз'їдання, був мінімальним,
якщо можливо.
Наприкінці тестування, яке триває, як правило, 4 години,
видаляють всі залишки речовини, використовуючи, якщо потрібно,
воду чи відповідний розчинник, не змінюючи отриманих результатів
на шкірі або цілісність епідермісу.
1.4.2.2. Рівень дозувань
Беруть дозу рідини із вмістом 0,5 мл, або 0,5 г сухої чи
пастоподібної речовини.
1.4.2.3. Початковий тест (на живих організмах:
ураження/роз'їдання шкіри на прикладі однієї тварини)
Дуже важливо, щоб тест на живих організмах проводився
спочатку на одній тварині, особливо тоді, коли є підозра того, що
речовина може мати ефект роз'їдання. Це відповідає вимогам
стратегії поступового тестування (див. Додаток 1).
Якщо роз'їдаючо-корозійні властивості речовини було виявлено
на основі аналізу фактичної ваги, тоді подальше тестування на
тваринах непотрібне. Більшість речовин, які можуть мати
корозійно-роз'їдаючі властивості, як правило, не потребують
подальшої тестової перевірки на живих організмах. Проте, в тих
випадках, коли додаткової інформації недостатньо через відсутність
достатніх доказів, обмежена кількість тестів допускається. При
цьому застосовується такий підхід:
На тварину в певній послідовності наносять три марлевих
клаптика з хімікатом. Через три хвилини забирають перший клаптик.
Якщо на шкірі не спостерігається жодної серйозної реакції, тоді
наносять другий марлевий клаптик з хімікатом, який знімають через
годину. Якщо на даній стадії спостережень буде виявлено, що
експеримент гуманним чином можна продовжити до 4 годин загалом,
тоді наноситься третій марлевий клаптик, який знімається через
4 години, а результати записують.
Якщо в ході одного з трьох етапів експерименту
спостерігатиметься ефект роз'їдання шкіри, тестування негайно
припиняють. У випадку, коли такого ефекту не спостерігається
навіть після закріплення останнього марлевого клаптика, за
твариною спостерігають 14 днів, за винятком, якщо ефект роз'їдання
шкіри з'являється раніше.
Якщо взята хімічна речовина, ймовірно, не є корозійною, а
лише спричиняє подразнення, тоді для нанесення її на тварину
застосовують лише один марлевий клаптик протягом 4 годин.
1.4.2.4. Тест-підтвердження (тестування на живих організмах
на предмет ураження/роз'їдання шкіри): дослід на додаткових
тваринах
Якщо ефект роз'їдання/корозії не спостерігається під час
початкового тесту, тоді необхідно отримати підтвердження про
подразнення або його відсутність, провівши дослід на двох
додаткових тваринах з нанесенням хімічної речовини на 4 години. У
випадку, коли ефект подразнення спостерігається в першому
тестуванні, послідовно проводять тест-підтвердження, або роблять
дослід на ще двох тваринах одночасно. В окремих випадках, якщо не
проводиться початковий тест, двом-трьом тваринам прикріпляють по
одному клаптику марлі з хімікатом, який знімають за 4 години.
Подальше тестування непотрібно, якщо беруть двох тварин, на яких
виявляють однакові результати. В іншому ж випадку тестують і третю
тварину. Необхідність використання додаткових тварин пояснюється
лише нечіткими та непереконливими результатами.
1.4.2.5. Період спостереження
Тривалість періоду спостереження повинна бути достатньою
настільки, щоб повною мірою оцінити оборотність отриманих ефектів.
Проте, експеримент необхідно зупинити в будь-який час, якщо
піддослідна тварина виявляє ознаки гострого болю або знедужання.
Щоб визначити оборотність отриманих результатів, за тваринами
потрібно спостерігати 14 днів після зняття марлевих клаптиків.
Якщо оборотність спостерігається раніше 14 днів, експеримент слід
припинити відразу.
1.4.2.6 Клінічні спостереження та класифікація реакцій шкіри
Всіх тварин необхідно перевірити на предмет появи в них ознак
еритеми (почервоніння шкіри) та набряків на 60-тій хвилині, а
потім через 24, 48 та 72 години після зняття марлевого клаптика з
речовиною. При проведенні початкового тесту над однією твариною
необхідно одразу після зняття марлі з хімікатом оглянути місце
проведення експерименту. Результати отриманих реакцій на шкірі
класифікують та записують, як показано нижче в Таблиці градацій.
Якщо ураження шкіри не класифікується, як подразнення або
роз'їдання на 72-ій годині експерименту, необхідно, при потребі,
проводити спостереження 14 днів, щоб визначити оборотність
ефектів. Крім спостережень за появою роз'їдання, необхідно
повністю описувати та фіксувати всі локальні ефекти, такі, як
обезжирення шкіри та будь-які систематичні шкідливі ефекти
(наприклад, клінічні ознаки токсичності та вага тіла). У випадку
появи нечітких або незрозумілих результатів проводять
гістопатологічний огляд.
Класифікація реакцій на шкірі є завжди суб'єктивною. Тому,
для узгодженості та координації в процесі класифікації рівнів
ураження шкіри, а також з метою допомогти лабораторіям та
персоналу під час отримання та інтерпретації результатів
спостережень, необхідно, щоб працівники мали належну підготовку та
кваліфікацію для підрахунку балів системи (див. подану нижче
Таблицю). Корисним може виявитись ілюстрований довідник з
класифікації результатів роз'їдання шкіри та інших уражень (9).
2. ДАНІ
2.1. ЗВІТНІСТЬ
Результати експерименту підсумовують у вигляді таблиці в
підсумковому звіті про результати. Таблиця повинна відображати всі
пункти, перелічені в секції 3.1.
2.2. ОЦІНЮВАННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Показники/бали подразнення шкіри оцінюються відповідно до
характеру та шкідливості уражень, а також їх оборотності або
необоротності. Індивідуальні показники не є абсолютним стандартом
в плані оцінки подразнюючих властивостей матеріалу, оскільки
проводиться оцінка інших ефектів тестованого матеріалу. Тож, такі
індивідуальні показники варто розглядати, як номінальні, стосовно
яких необхідно робити порівняння з іншими, отриманими в ході
експерименту, величинами.
Під час оцінки результатів подразнення шкіри необхідно
враховувати оборотність отриманих уражень. Якщо такі ознаки, як
облисіння (невелика ділянка), гіперкератоз, гіперплазія та лущення
шкіри продовжуються до 14 дня спостереження, тоді речовину
вважають такою, що спричиняє подразнення.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТИ ТЕСТУ
Звітність про результати тесту, якщо можливо, повинна містити
наступну інформацію:
Підстава для проведення тесту на живих організмах: аналіз
фактичної ваги (на основі попередніх даних тестування, включаючи
результати стратегії поетапного тестування):
- опис відповідних даних з попереднього тестування,
- дані, отримані на кожному етапі стратегії тестування,
- опис виконаних тестів на живих організмах, включаючи деталі
проведення процедур, результати, отримані в ході тестування
базових речовин,
- аналіз фактичної ваги для проведення досліду на живих
організмах.
Речовина для тестування:
- дані ідентифікації (наприклад, номер CAS, походження
хімікату, відсутність домішок, наявні домішки, номер партії),
- фізичні характеристики та фізико-хімічні властивості
(наприклад, рН, змінність, розчинюваність, стійкість),
- якщо це суміш - її склад та співвідношення компонентів у
відсотках.
Технологічна рідина:
- ідентифікація, концентрація (якщо потрібно), об'єм,
- доцільність застосування технологічної рідини.
Піддослідні тварини:
- види та роди тварин, обґрунтована доцільність використання
інших тварин (не кроликів),
- кількість тварин кожної статі,
- індивідуальна вага тварин на початку та наприкінці тесту,
- вік тварин на момент експерименту,
- походження тварин, умови утримання тощо.
Умови проведення тестування:
- техніка підготовки ділянки, на яку наноситиметься хімікат,
- інформація про матеріали, що використовуються для
підготовки ділянки, на яку наноситиметься хімікат,
- деталі щодо приготування тестованої речовини, її
застосування/нанесення та зняття.
Результати:
- зведення в таблицю інформації про кожну тварину: показники
подразнення/роз'їдання шкіри, які замірювались постійно,
- опис уражень шкіри в ході спостережень,
- детальний опис особливостей та рівня подразнення або
роз'їдання в ході спостереження, а також будь-які гістопатологічні
дані,
- опис інших шкідливих локальних (наприклад, обезжирення
шкіри) та систематичних ефектів, в додаток до вже описаних ефектів
ураження або роз'їдання шкіри,
- обговорення результатів.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes,
R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray,
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J. J.L.,
Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop
Report 8. ATLA 23, p. 410-429.
2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988)
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on
Animals. Toxicollogy In Vitro, 2, p. 19-26.
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A.,
Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998)
Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin
corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
(4) ECETOC (1990) Monograph No 15, 'Skin Irritation',
European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre,
Brussels.
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A.,
Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G.and
Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the
Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
(5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report
of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance
Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in
Solna, Sweden, 22-24 January 1996
(http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).
(7) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical
Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998
(http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition,
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental
Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment
No 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm).
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and
Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
(Дані публікації можна отримати на вимогу в Секретаріаті
ОЕСР).
Таблиця 1
КЛАСИФІКАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ РЕАКЦІЇ НА ШКІРІ

Інформація про появу почервоніння та струпів
Почервоніння (еритема) .................................... 0
Легке почервоніння (ледве помітне) ........................ 1
Явно виражене почервоніння ................................ 2
Почервоніння середнього та високого рівня ................. 3
Дуже сильне почервоніння (яловиче почервоніння) або утворення струпів, ще не класифікується, як еритема ....... 4
Максимально можливе: 4
Утворення набряків
Набряки відсутні .......................................... 0
Ледь помітний набряк (легкої форми) ....................... 1
Легкий набряк (краї шкіри явно виражені та припідняті)..... 2
Набряк середньої форми (краї шкіри припідняті, приблизно, на 1 мм) ....................................... 3
Сильний набряк (краї шкіри припідняті більше, ніж на 1 мм та заходять за визначену ділянку) ................. 4
Максимально можливе: 4
Якщо результати досліджень нечіткі або незрозумілі, тоді
проводять гістопатологічний огляд.

Додаток

Стратегія поступового тестування
на предмет оцінки подразнення та роз'їдання шкіри

ЗАГАЛЬНИЙ РОЗГЛЯД
З метою розумного наукового підходу та охорони життя тварин
дуже важливо уникати зайвого проведення досліджень на живих
істотах, а також мінімізувати можливість будь-яких експериментів,
в ході яких тваринам, ймовірно, буде завдано серйозної шкоди.
Перед тим, як розглянути саму можливість проведення тестів на
живих організмах, необхідно зробити оцінку інформації щодо
можливого ураження шкіри: подразнення та роз'їдання. Потреба в
проведенні досліджень над тваринами може виявитись зайвою, якщо
вже є достатньо інформації щодо класифікації хімічної речовини на
предмет ураження та роз'їдання шкіри. Таким чином, застосування
аналізу фактичної ваги та стратегії поступового тестування зможуть
мінімізувати потребу в проведенні тесту на живих організмах, якщо
тестована речовина може викликати шкідливі реакції.
Метод аналізу фактичної ваги рекомендується застосовувати для
того, щоб оцінити доступну інформацію щодо подразнення та
роз'їдання шкіри хімічною речовиною з метою визначення потреби в
проведенні додаткових досліджень, які відрізняються від
експериментів на живих організмах. Якщо потреба в подальших
дослідженнях все ж існує, тоді рекомендується застосовувати
стратегію поступового тестування для розробки та вдосконалення
відповідних експериментальних даних. Метод аналізу фактичної ваги
застосовується до тих хімічних речовин, про які відсутня будь-яка
історія досліджень, з метою розробки даних для оцінки потенційно
можливих ефектів ураження та роз'їдання шкіри. Описана в даному
Доповненні стратегія тестування була розроблена в ході семінару
ОЕСР (1), згодом затверджена і розвинута в Глобальній
Гармонізованій Системі (ГГС) Класифікації Хімічних Речовин щодо
впливу на здоров'я людини та навколишнє середовище. Рішення будо
затверджено 28 листопада 1998 року, під час 28-го Спільного
скликання хімічного комітету та Робочої групи з дослідження
хімічних речовин (2).
Незважаючи на те, що стратегія поступового тестування не є
компонентом методу В.4, вона все ж носить рекомендаційний характер
щодо визначення характеристик подразнення/роз'їдання шкіри. Такий
рекомендаційний характер даної стратегії представляє собою, як
передовий досвід, так і певні етичні критерії оцінки результатів
досліду на живих організмах на предмет виявлення ефектів
подразнення та роз'їдання шкіри. Метод тестування дає рекомендації
щодо проведення експерименту на живих організмах, а також
підсумовує показники, на які варто звернути увагу ще до початку
самого тестування. Стратегія являє собою підхід до оцінки вже
існуючої бази даних про роз'їдаючі властивості хімічних речовин, а
також багаторівневий підхід щодо формування відповідних даних про
речовини, які потребують додаткового вивчення або про які не
проводилось жодних досліджень. Дана стратегія також рекомендує
проведення в певних умовах вже оцінених та загальноприйнятих
тестів на живих організмах або в пробірці з метою визначення
подразнення/роз'їдання шкіри.
СТРАТЕГІЯ ТЕСТУВАННЯ ТА ОПИС ОЦІНЮВАННЯ
Перед проведенням тестів, як елементу стратегії поступового
тестування (див. Малюнок), необхідно зробити оцінку існуючої з
даного питання інформації, щоб визначити потребу в дослідах на
живих організмах. Незважаючи на те, що важливу інформацію можна
отримати з оцінки окремих параметрів (наприклад, крайнє значення
рН), необхідно враховувати всю інформацію в цілому. Сумнівна
інформація про дію речовини або її аналогів повинна перевірятись
методом оцінки фактичної ваги, а рішення про застосування такого
методу необхідно обґрунтувати. Особливо підкреслити необхідно вже
існуючу інформацію про дію речовини на тварин та людей, а також
результати досліджень на живих організмах і в пробірці. Необхідно
уникати, якщо можливо, проведення експериментів над тваринами
(живими організмами) на предмет виявлення роз'їдаючих властивостей
хімічної речовини. До показників стратегії тестування входить
наступна інформація:
Оцінка даних про дію хімічної речовини на тварин та людей
(Етап 1). Першими беруться до уваги результати дії речовини на
людях, наприклад, дані клінічних та професійних досліджень,
доповіді, результати щодо тварин (наприклад, окремі та повторювані
експерименти щодо визначення токсичності ураження шкіри). Така
інформація враховується першою, оскільки безпосередньо стосується
дії речовини на шкіру. Під час проведення експериментів на живих
організмах непотрібно застосовувати хімічні речовини, які відомі
своєю роз'їдаючою та подразнюючою дією або, навпаки, не проявляють
таких ознак.
Аналіз залежності речовини від структури (ЗРВ) (Етап 2).
Результати тестування структурно пов'язаних хімічних речовин
необхідно при можливості враховувати. Якщо є достатньо інформації
про структурно пов'язані речовини або суміші таких речовин, а
саме, їх роз'їдаючу та подразнюючу дію на людей та/чи тварин, тоді
можна припустити, що тестована речовина продемонструє такі самі
результати. За таких умов даний хімікат тестувати непотрібно.
Негативні результати досліджень структурно пов'язаних речовин або
їх сумішей не дають достатніх доказів про відсутність роз'їдаючої
та подразнюючої дії хімічної речовини під час використання
стратегії поступового тестування. Для визначення можливості ефекту
подразнення та роз'їдання шкіри необхідно застосовувати
загальноприйняті та оцінені методи ЗРВ.
Фізичні та хімічні властивості, хімічна активність (Етап 3).
Сильнодіючими можуть виявитись хімічні речовини з крайнім
значенням рН, а саме: <= 2,0 та >= 11,5. Якщо крайнє значення рН є
основним при визначенні роз'їдаючої дії речовини на шкіру, тоді
також можна брати до уваги такі характеристики речовини, як
кислотно-лужний резерв (або буферну ємність) (3)(4). Якщо з
буферної ємності випливає, що взята речовина не може проявляти
роз'їдаючої дії на шкірі, тоді варто далі проводити дослідження,
щоб цей факт можна було підтвердити. Для цього застосовують
загальноприйняте тестування в пробірці або на живих організмах
(коли доза вводиться спочатку в ізольовані клітини, а потім в
організм тварини) - див. етапи 5, 6.
Шкірна токсичність (Етап 4). Якщо хімічна речовина
виявляється досить токсичною після нанесення на шкіру, дослідження
ефектів роз'їдання/подразнення шкіри на живих організмах не
практикують, оскільки та кількість речовини, що, як правило
застосовується, може перевищити максимально допустиму дозу
токсичності, і, відповідно, призвести до загибелі тварин або
спричинити сильний біль. Крім того, коли проведені на
кроликах-альбіносах досліди шкірної токсичності показують, що при
застосуванні дози в 2000 мг/кг (відносно ваги) або більше, не було
виявлено жодних ознак подразнення чи роз'їдання, подальші
дослідження в цьому напрямку непотрібні. Під час оцінки гострої
шкірної токсичності слід враховувати ряд факторів. Так, наприклад,
інформації про ураження шкіри може виявитись недостатньо.
Тестування та спостереження могли проводитись на інших видах
тварин (не на кроликах), які можуть суттєво відрізнятись
чутливістю до хімічної речовини. Також, форма тестованої речовини,
що наноситься на тіло тварини, може бути невідповідною для оцінки
ефекту роз'їдання/подразнення шкіри (наприклад, розріджування
речовин для перевірки шкірної токсичності (5)). Проте, в тих
випадках, коли на кроликах проводились добре розроблені та
організовані експерименти для виявлення шкірної токсичності,
отримані в результаті цього негативні результати можна вважати
достатнім доказом того, що хімічна речовина не викликає
подразнення або роз'їдання.
Результати тестів в пробірці або на живих організмах (коли
доза вводиться спочатку в ізольовані клітини, а потім в організм
тварини) (Етап 5, 6). На тваринах непотрібно тестувати хімічні
речовини, які виявили подразнюючу та роз'їдаючу дію під час
проведення спеціально розроблених для цього тестів в пробірці або
на живих організмах (коли доза вводиться спочатку в ізольовані
клітини, а потім в організм тварини) (6)(7). Можна припустити, що
такі хімікати продемонструють подібні шкідливі ефекти під час
експериментів на живих організмах (де доза вводиться одразу в
організм тварини).
Тести на кроликах (Етап 7, 8). У випадку, якщо буде прийнято
рішення про застосування аналізу фактичної ваги для проведення
тестування на живих організмах, починати необхідно з початкового
тесту на одній тварині. Якщо результати покажуть, що речовина має
подразнюючу/роз'їдаючу дію, тоді подальше тестування непотрібно.
І, навпаки, коли в першому тестуванні такого ефекту не
спостерігається, необхідно взяти ще двох додаткових тварин і
провести над ними експеримент для підтвердження ефекту роз'їдання
або подразнення шкіри. Якщо ефект подразнення спостерігається вже
в початковому тестуванні, тоді тест-підтвердження проводять
поетапно або тестуючи двох тварин одночасно.
ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, (1996) Test Guidelines Programme: Final Report on
the OECDWorkshop on Harmonisation of Validation and Acceptance
Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on
Solna, Sweden, 22-24 January 1996
(http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(2) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification
System for Human Health and Environmental Effects ow Chemical
Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998
(http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A.,
Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M., (1998). An
Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin
Corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H.,
(1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin ow
Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without
Testing on Animals. Toxicology In Vitro, 2(1), p. 19-26.
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal,
Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation,
in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors):
Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31,
p. 411-436.
(6) Testing Method B.40.
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A.,
Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and
Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the
Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.

Малюнок
СТРАТЕГІЯ ТЕСТУВАННЯ
ТА ОЦІНКИ ШКІРНОГО ПОДРАЗНЕННЯ/РОЗЇДАННЯ
Діяльність Результат Висновок
----------------- 1. |Існуючі дані | Роз'їдання Найвищий показник; |про ефект | вважається роз'їданням. |ураження шкіри | Тестування непотрібно. |або слизової | |оболонки людини| Подразнення Найвищий показник; |та/чи тварини | вважається подразненням. ----------------- Тестування непотрібно. | | Ефект Найвищий показник; | подразнення/ ефект | роз'їдання подразнення/роз'їдання | відсутній відсутній | Тестування непотрібно. | | | | \/
Інформація відсутня або непереконлива
----------------- 2. |Проведіть | Передбачається Вважається роз'їданням. |оцінку ЗРВ | сильне Тестування непотрібно. |на предмет | ураження шкіри |роз'їдання/ | |подразнення | Передбачається Вважається подразненням. |шкіри | подразнення шкіри Тестування непотрібно. ----------------- | | | \/
Прогнозування неможливе
або не допускає роз'їдання
чи негативного результату
----------------- 3. |Виміряйте рН | рН <= 2,0 та >= 11,5 Роз'їдання допускається. |(враховуючи | (при великій Тестування непотрібно. |буферну | буферній ємності, |ємність, якщо | якщо потрібно) |потрібно) | ----------------- | \/
2 < рН < 11,5 або рН <= 2,0 та >= 11,5
при малій буферній ємності/або її
відсутності, якщо потрібно
----------------- 4. |Проведіть | Сильна токсичність Потрібне подальше |оцінку даних | тестування. |про | |систематичну | Ефект Роз'їдання/подразнення |токсичність дії| роз'їдання/подразнення не допускається. |на шкіру(1) | відсутній під час Подальше тестування ----------------- тестування на кроликах непотрібно. | при обмеженій дозі, що | становить 2000 мг/кг | або більше \/
Така інформація недоступна
або вважається непереконливою
----------------- 5. |Необхідно | Роз'їдання Роз'їдання допускається |провести | під час досліду на живих |оцінені та | організмах. Подальше |загально- | тестування непотрібно. |прийняті | |тестування в | |пробірці та на | |живих | |організмах | |(коли доза | |вводиться | |спочатку в | |ізольовані | |клітини, а | |потім | |в організм | |тварини) на | |предмет | |роз'їдання | |шкіри | ----------------- | \/
Речовина не має роз'їдаючої дії
----------------- 6. |Необхідно | Подразнення Роз'їдання допускається |провести | під час досліду на живих |оцінні та | організмах. Подальше |загально- | тестування непотрібно. |прийняті | |тестування в | |пробірці та | |на живих | |організмах | |(коли доза | |вводиться | |спочатку в | |ізольовані | |клітини, а | |потім в | |організм | |тварини) на | |предмет | |подразнення | |шкіри | ----------------- | \/
Коли відсутні загальноприйняті
методи тестування в пробірці або
на живих організмах (коли хімікат
спочатку вводиться в клітину
ізольовано) на предмет подразнення
шкіри, або хімічна речовина
не викликає подразнення
----------------- 7. |Проведіть | Сильне ураження Ефект роз'їдання. |початковий тест| шкіри Подальше тестування |над кроликом | непотрібно. |(лише одна | |тварина) | ----------------- | \/
Сильного ураження немає
----------------- 8. |Проведіть тест-| Роз'їдання або Ефект роз'їдання або |підтвердження | подразнення подразнення. |на ще одній | Подальше тестування |або двох | непотрібно. |тваринах | ----------------- Відсутність Немає ефекту роз'їдання роз'їдання або чи подразнення.
подразнення Подальше тестування непотрібно.

---------------- (1) береться до уваги перед Етапом 2, 3.

B.5. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ: ПОДРАЗНЕННЯ ОКА/РОЗ'ЇДАННЯ
1. МЕТОД
Цей метод еквівалентний методу, описаному у ТІ
ОЕСР 405 (2002).
1.1. ВСТУП
При підготовці цього оновленого методу особлива увага
приділялася можливості вдосконалення шляхом оцінки наявної
інформації щодо досліджуваної речовини з метою уникнення зайвих
досліджень на лабораторних тваринах, враховуючи, таким чином,
питання захисту тварин. Цей метод містить наступну рекомендацію:
перш ніж проводити описане дослідження гострого подразнення
ока/роз'їдання in vivo, потрібно здійснити аналіз вагомих
доказів (1) на основі існуючих відповідних даних. Якщо наявних
даних недостатньо, рекомендується розробляти їх шляхом
застосування послідовних тестувань (2)(3). Стратегія тестувань
включає виконання затверджених і прийнятих досліджень in vitro і
розглядається в Додатку до методу дослідження. Додатково
рекомендується застосування дослідження подразнення/роз'їдання на
шкірі in vivo для передбачення подразнення ока, перш ніж проводити
дослідження на оці живих організмів.
В інтересах як фундаментальної науки, так і захисту тварин,
не слід вдаватися до досліджень in vivo до проведення оцінки
методом аналізу вагомих доказів всіх доступних даних, що
стосуються потенційної корозійної активності/подразнення речовиною
ока. Такі дані включатимуть дані, отримані з існуючих досліджень
на людях та/або лабораторних тваринах, дані щодо корозійної
активності/подразнення однієї або більше структурно подібних
речовин або суміші таких речовин, дані, що демонструють високу
кислотність або лужність речовини (4)(5), та результати
затверджених і прийнятих досліджень роз'їдання/подразнення шкіри в
лабораторних умовах і на неживих організмах (6)(6a). Дослідження
потрібно проводити до проведення аналізу вагомих доказів, або
після проведення цього аналізу.
Для певних речовин такий аналіз може означати необхідність в
проведенні дослідження на живих організмах роз'їдання
ока/потенціалу подразнення речовини. В усіх зазначених випадках
перед проведенням випробування на оці живого організму доцільно
провести спочатку дослідження впливу речовини на шкіру і оцінити
результати згідно з методом випробування B.4 (7). Застосування
методу аналізу вагомих доказів і стратегії послідовних випробувань
зменшує потребу в проведенні випробувань на живих організмах для
виявлення корозійної активності/подразнення для речовин, щодо яких
вже отримано достатньо результатів у ході інших досліджень. Якщо
визначення корозійного потенціалу або потенціалу подразнення щодо
ока не може бути виявлене за допомогою стратегії послідовних
випробувань, навіть після застосування дослідження впливу
роз'їдання або подразнення на шкіру живих організмів, можливе
проведення дослідження впливу роз'їдання/подразнення на око живих
організмів.
Стратегія послідовних випробувань, що включає в себе
застосування затверджених досліджень роз'їдання/подразнення в
лабораторних умовах та на неживих організмах, якій надається
перевага, внесена у Додаток до цього методу випробування.
Стратегію було розроблено і одностайно рекомендовано учасниками
семінару ОЕСР, а також було внесено як рекомендовану стратегію
випробувань у склад Всесвітньо Гармонізованої Системи Класифікації
Хімічних Речовин (ВГС) (9). Рекомендується використовувати цю
стратегію випробувань перед проведенням випробувань на живих
організмах. Для нових речовин рекомендований поетапний підхід до
випробувань з метою отримання науково вагомих даних щодо
корозійної активності/подразнення речовини. Для існуючих речовин,
щодо яких немає достатньої кількості даних про
роз'їдання/подразнення очей і шкіри, ця стратегія застосовується з
метою заповнення прогалин у даних. Використання іншої стратегії
або процедури випробувань, або рішення не використовувати
поетапний підхід до випробувань має бути виправданим.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Подразнення ока: зміни в оці, викликані застосуванням
досліджуваної речовини до зовнішньої поверхні ока, які повністю
зворотні впродовж 21 дня після застосування.
Роз'їдання очей: пошкодження тканини ока або серйозні фізичні
розлади зору, викликані застосуванням досліджуваної речовини до
зовнішньої поверхні ока, які повністю зворотні впродовж 21 дня
після застосування.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Речовина, що випробовується, застосовується в одиничній дозі
до одного з очей піддослідної тварини; неушкоджене око
використовується в якості контрольного. Ступінь
подразнення/роз'їдання ока розраховується шляхом оцінювання
пошкоджень кон'юнктиви, роговиці і райдужної оболонки через
визначені проміжки. Інші впливи на око і шкідливі для здоров'я
системні впливи також описані для повноти оцінки впливів.
Тривалість дослідження має бути достатньою для оцінки зворотності
або незворотності впливів.
Тварини, що демонструють постійні ознаки сильних страждань
та/або болю на будь-якому етапі досліджень, підлягають знищенню
гуманним способом, а речовині надається відповідна оцінка.
Критерії для прийняття рішення щодо гуманного знищення помираючих
або сильно страждаючих тварин можна знайти за посиланням(10).
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка до досліджень на живих організмах
1.4.1.1. Вибір біологічних видів
Кролик-альбінос якнайкраще підходить для лабораторних
досліджень; для досліджень обирають здорових молодих дорослих
тварин. Для використання інших ліній біологічних видів потрібне
обґрунтування.
1.4.1.2. Підготовка тварин
Огляд обох очей кожної з попередньо вибраних піддослідних
тварин проводиться за 24 години до початку випробування. Тварини,
що мають прояви подразнення очей, ушкодження очей або вже існуючі
ураження рогівки, не підлягають використанню.
1.4.1.3. Умови утримання і годування
Тварин потрібно утримувати окремо. Температура у приміщенні,
де утримуються піддослідні тварини має становити 20 град.C
(+- 3 град.C) для кроликів. Хоча відносна вологість має становити
принаймні 30% і не перевищувати 70%, крім часу прибирання
приміщення, оптимальним значенням є 50-60%. Освітлення має бути
штучним, у наступній послідовності: 12 годин світла, 12 годин
темряви. Стосовно годування, можливе використання узгоджених
лабораторних дієт з безперервним постачанням питної води.
1.4.2. Процедура дослідження
1.4.2.1. Застосування досліджуваної речовини
Досліджувану речовину слід помістити в кон'юнктивальний мішок
одного ока кожної тварини після того, як обережно відтягли нижню
повіку від очного яблука. Потім повіки слід обережно притиснути
одна до одної впродовж однієї секунди з метою запобігання втрати
речовини. Інше око, що залишається неушкодженим, використовується
в якості контрольного.
1.4.2.2. Зволоження
Очі піддослідних тварин не слід промивати протягом принаймні
24 годин після введення досліджуваної речовини, окрім випадків
введення твердих речовин (див. Розділ 1.4.2.3.2) та негайного
роз'їдаючого або подразнюючого ефекту. Через 24 години можна у
випадку необхідності промити око.
Використання супутньої групи тварин для вивчення впливу
промивання не рекомендується, якщо це не є науково обґрунтованим.
Якщо є потреба в супутній групі, слід використати двох кроликів.
Умови промивання, як от: час промивання, склад і температура
розчину для промивання, тривалість, об'єм рідини і швидкість
застосування, необхідно ретельно задокументувати.
1.4.2.3. Рівень дозування
1.4.2.3.1. Тестування рідин
Для тестування рідин використовується доза 0,1 мл. Спрей з
розпилювачем не використовується для введення речовини
безпосередньо в око. Рідкий спрей слід виштовхувати і збирати в
контейнер перед введенням дози 0,1 мл в око.
1.4.2.3.2. Тестування твердих речовин
При тестуванні твердих речовин, паст і порошкових речовин,
кількість використовуваної речовини має становити 0,1 мл або не
більше 100 мг. Досліджуваний матеріал має бути подрібненим на
дрібний пил. Об'єм твердого матеріалу слід вимірювати після
обережного ущільнення, наприклад, шляхом постукування мірного
контейнера. Якщо тверда досліджувана речовина не вивелася з ока
піддослідної тварини завдяки фізіологічним механізмам в перший
проміжок спостереження впродовж однієї години після втручання, око
можна промити сольовим розчином або дистильованою водою.
1.4.2.3.3. Тестування аерозолів
Рекомендується зібрати спреї з розпилювачем і аерозолі перед
закапуванням в око. Єдиний виняток становлять речовини в
запресованих аерозольних контейнерах, які неможливо зібрати через
випаровування. В таких випадках око слід тримати відкритим, а
досліджувану речовину ввести в око простим викидом тривалістю біля
однієї секунди на відстані 10 см прямо перед оком. Ця відстань
може варіюватися в залежності від тиску розпилювача і його вмісту.
Необхідно подбати про те, щоб не пошкодити око тиском розпилювача.
У випадках, коли це є доцільним, може виникнути потреба виміряти
потенціал "механічного" пошкодження ока силою розпилювача.
Оцінка дози аерозолю може проводитись за допомогою наступного
способу моделювання випробування: речовина розпилюється на папір
для зважування через отвір розміром з око кролика, розташований
безпосередньо перед папером. Збільшення ваги паперу
використовується для визначення приблизної кількості речовини,
розпиленої в око. Для летючих речовин дозу можна оцінити, зважуючи
приймаючий контейнер до та після видалення досліджуваного
матеріалу.
1.4.2.4. Початкове тестування (дослідження впливу
роз'їдання/подразнення на око живого організму з використанням
однієї тварини)
Як зазначено в стратегії послідовних випробувань
(див. Додаток 1), наполегливо рекомендується проведення
дослідження на живому організмі, використовуючи спочатку одну
тварину.
Якщо результати випробування показують, що речовина є
роз'їдаючою або викликає сильне подразнення ока за умови
використання описаної процедури, подальші дослідження
подразнюваності ока необхідно припинити.
1.4.2.5. Місцева анестезія
Місцева анестезія може використовуватись в окремих випадках.
Якщо аналіз вагомих доказів показує, що речовина потенційно може
викликати біль, або попередні випробування виявили можливість
болісних реакцій, можливе застосування місцевої анестезії перед
закапуванням досліджуваної речовини. Тип, концентрацію і дозу
місцевої анестезії слід ретельно добирати, щоб переконатися, що
різниця в реакції на досліджувану речовину не є результатом
використання анестезії. Контрольне око також має бути
анестезоване.
1.4.2.6. Підтверджувальне тестування (дослідження впливу
подразнення на око живого організму з використанням додаткових
тварин)
Якщо роз'їдаючого впливу під час початкового тестування не
спостерігалось, подразнення або негативна реакція має бути
підтверджена використанням додатково до двох тварин. Якщо під час
початкового випробування спостерігався сильний подразнюючий ефект,
що вказує на можливий сильний (незворотній) вплив під час
підтверджувального випробування, рекомендується проводити
підтверджувальне випробування послідовним способом на одній
тварині за один раз, а не з використанням двох додаткових тварин
одночасно. Якщо у другої тварини проявляється роз'їдаючий або
сильний подразнюючий ефект, випробування не продовжують. Для
підтвердження слабких або помірних реакцій подразнення може
виникнути потреба в використанні додаткових тварин.
1.4.2.7. Період спостереження
Тривалість періоду спостереження має бути достатньою для
повної оцінки величини та зворотності виявлених впливів. Проте,
експеримент слід припинити на будь-якому етапі, якщо тварина
демонструє постійні ознаки сильного болю або страждань(9). Для
визначення зворотності впливів необхідно спостерігати за твариною
впродовж 21 дня після застосування досліджуваної речовини. Якщо
зворотні ефекти спостерігається раніше, ніж через 21 день, слід
припинити експеримент в цей момент.
1.4.2.7.1. Клінічні спостереження і класифікація реакцій ока
Очі необхідно оглянути через 1, 24, 48 і 72 години після
застосування досліджуваної речовини. Тварин слід піддавати
дослідженням не довше, ніж потрібно для отримання остаточної
інформації. Тварини, що демонструють постійний сильний біль або
страждання, підлягають невідкладному знищенню гуманним способом, а
речовині дається відповідна оцінка. Тварини з наступними
ураженнями ока після закапування підлягають знищенню гуманним
способом: рогівкова перфорація або значна кількість рогівкових
виразок включаючи стафілому; кров у передній камері ока;
непрозорість рогівки 4 ступеню, що зберігається впродовж 48 годин;
відсутність реакції зіниці на світло (реакція райдужки другого
ступеню), що зберігається впродовж 72 годин; утворення виразок
кон'юнктивальної мембрани; некроз кон'юнктиви або мигальної
перетинки; або відторгнення некротичних мас. Такі ураження
зазвичай є незворотними.
Тварини, у яких ураження ока не прогресують, можуть бути
знищені не раніше, ніж через три дні після закапування. За
тваринами з м'якими або помірними ураженнями потрібно спостерігати
до того, як вони зникнуть, або впродовж 21 дня, тобто до
закінчення дослідження. Спостереження необхідно проводити через 7,
14 та 21 день з метою визначення статусу уражень, а також їх
зворотності або незворотності.
Ступінь реакцій ока (кон'юнктиви, роговиці і райдужної
оболонки) потрібно фіксувати при кожному огляді (Таблиця 1). Про
всі інші ураження ока (наприклад, паннус, забарвлювання) або
шкідливі для здоров'я системні впливи також потрібно повідомляти.
Перевірка реакцій може бути полегшена використанням
бінокулярної лупи, ручної щілинної лампи, біомікроскопу або іншого
відповідного приладу. Після запису спостережень через 24 години
можливе проведення подальшого огляду за допомогою флуоресцину.
Класифікація реакцій ока обов'язково є суб'єктивною. Для
гармонізації процесу класифікації реакцій ока і з метою допомоги
дослідним лабораторіям і тим, хто бере участь у здійсненні та
інтерпретації спостережень, персонал, що проводить спостереження,
має бути відповідно проінструктованим щодо використовуваної
системи оцінювання.
2. ДАНІ
2.2. ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Оцінку подразнення ока слід проводити в поєднанні з оцінкою
природи та сили уражень, та їх зворотності чи їх відсутності.
Індивідуальна оцінка не являє собою абсолютного стандарту щодо
подразнюючих якостей матеріалу, тому інші впливи досліджуваного
матеріалу також оцінюються. Навпаки, індивідуальну оцінку не слід
розглядати як опорну величину; вона є суттєвою тільки тоді, коли
підтверджується повним описом і оцінкою всіх спостережень.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
Звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:
Обґрунтування для дослідження на живому організмі: аналіз
вагомих доказів, отриманих з вже існуючих випробувань, включаючи
результати, отримані за допомогою стратегії послідовних
випробувань.
- опис відповідних даних попередніх тестувань,
- дані, отримані з кожного етапу стратегії тестування,
- опис здійснених тестувань в лабораторних умовах, включаючи
деталі процедур, результати, отримані щодо досліджуваних/еталонних
речовин,
- опис здійснених досліджень впливу подразнення/роз'їдання на
шкіру живого організму, включаючи отримані результати,
- аналіз вагомих доказів для здійснення дослідження на живому
організмі.
Досліджувана речовина:
- ідентифікаційні дані (наприклад, номер РСХ (Реферативної
служби з хімії), джерело, ступінь очищення, відомі домішки, номер
партії),
- фізична природа і фізико-хімічні властивості ( наприклад,
pH, летючість, розчинність, стабільність, реактивність з водою),
- у випадку використання суміші, склад і процентний вміст
компонентів,
- при використанні місцевої анестезії, ідентифікація, ступінь
очищення, тип, доза та потенційна взаємодія з досліджуваною
речовиною.
Розчинник:
- ідентифікація, концентрація (якщо потрібно), використаний
об'єм,
- обґрунтування для вибору розчинника.
Піддослідні тварини:
- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,
обґрунтування для використання інших тварин, окрім
кроликів-альбіносів,
- вік кожної тварини на початку дослідження,
- кількість тварин кожної статі в піддослідній і контрольній
групах (якщо вимагається),
- вага кожної тварини на початку і наприкінці випробування,
- походження, умови утримання, дієта, і т.д.
Результати:
- опис методу, використаного для оцінювання ступеню
подразнення в кожний період спостереження (наприклад, ручної
щілинної лампи, біомікроскопу або іншого відповідного приладу),
- табличні дані реакції подразнення/роз'їдання для кожної
тварини в кожний період спостереження до вилучення кожної тварини
з процесу випробування,
- текстовий опис ступеню і природи подразнення або
роз'їдання, що спостерігалося,
- опис всіх інших уражень ока (наприклад, васкуляризація,
утворення паннуса, рубці, забарвлювання),
- опис місцевих і системних шкідливих для здоров'я впливів на
інші органи, крім очей, та гістопатологічні показники, якщо вони
є.
Обговорення результатів.
3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Екстраполяція результатів досліджень подразнення ока у
лабораторних тварин дійсна для людини тільки до певної міри. В
багатьох випадках кролик-альбінос проявляє більшу чутливість до
подразнюючих або роз'їдаючих око речовин, ніж людина.
Потрібна обережність в інтерпретації даних з метою виключення
подразнення, спричиненого вторинною інфекцією.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes,
R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray,
T.J. B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L.,
Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop
Report 8. ATLA 23, p. 410-429.
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux,
P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E.,
Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N., (1997) Evaluation of Eye
Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing
Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159-164.
(3) Worth A.P. and Fentem J.H., (1999) A general approach for
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, p. 161-177
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H.,
(1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of
Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without
Testing on Animals. ToxicollogyIn Vitro, 2, p. 19-26.
(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye
Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single
pH.J.Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A.,
Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and
Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the
Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
(6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.
(7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal
irritation/corrosion.
(8) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report
of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance
Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in
Solna, Sweden, 22-24 January 1996
(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(9) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical
Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998
(http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(10) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition,
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental
Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment
No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.
Таблиця 1
КЛАСИФІКАЦІЇ УРАЖЕНЬ ОКА
Рогівка
Непрозорість: ступінь щільності (виміри слід проводити в найщільнішій області)(*)
Немає утворення виразок або непрозорост ................... 0
Окремі або розсіяні області непрозорості (крім незначного помутніння від звичайного відблиску); елементи райдужки чітко видимі .................................................... 1
Легко визначається напівпрозора область; елементи райдужки мають незначне затемнення ................................. 2
Перламутрова область; елементи райдужки невидимі; розмір зіниці майже не визначається ....................... 3
Мутна рогівка, райдужка не визначається через непрозорість ........................................ 4
Максимально можливо: 4
ПРИМІТКИ
(*) Необхідно відмітити область помутніння рогівки
Райдужка
Нормальна ................................................. 0
Помітно поглиблені зморшки, гіперемія, набухання, помірна гіперемія навкруги рогівки або ін'єкції; райдужка реагує на світло (в'яла реакція розглядається як вплив) ............. 1
Крововилив, макроскопічне руйнування або відсутність реакції на світло ......................................... 2
Максимально можливо: 2
Кон'юнктива
Почервоніння (стосується пальпебральної кон'юнктиви та кон'юнктиви очного яблука, за винятком рогівки та райдужки)
Нормальна ................................................. 0
Деякі кровоносні судини є гіперемічними (ін'єктованими) ... 1
Розпливчастий, малиновий колір; окремі судини неможливо легко визначити ........................................... 2
Розпливчастий яскраво червоний ............................ 3
Максимально можливо: 3
Хемоз
Набухання (стосується повік та/або мигальних перетинок)
Нормальна ................................................. 0
Набухання дещо вище норми ................................. 1
Очевидне набухання з частковою еверсією повік ............. 2
Набухання з майже наполовину закритими повіками ........... 3
Набухання з повіками, закритими більш ніж наполовину ...... 4
Максимально можливо: 4

Додаток

Стратегія проведення
послідовних досліджень подразнення
та роз'їдання ока

ЗАГАЛЬНИЙ ОГЛЯД
В інтересах фундаментальної науки і захисту тварин важливо
уникати зайвого використання тварин та мінімізувати випробування,
що можуть викликати важкі реакції у тварин. Необхідно оцінити всю
інформацію стосовно подразнення/роз'їдаючої активності речовини
для ока перш ніж проводити дослідження in vivo. Вже отримано
достатньо результатів для класифікації досліджуваної речовини з
точки зору її потенціалу роз'їдання або подразнення ока, і немає
потреби проводити випробування на лабораторних тваринах. Отже,
застосування аналізу вагомих доказів та стратегії послідовних
випробувань мінімізує потребу у проведенні випробувань in vivo,
особливо якщо речовина може викликати важкі реакції.
Для оцінки існуючої інформації щодо подразнення та роз'їдання
очей речовинами та з метою визначення необхідності проведення
інших, не in vivo, досліджень на оці з метою визначення такого
потенціалу рекомендується застосування аналізу вагомих доказів.
Якщо виникне потреба в подальших дослідженнях, рекомендується
застосування стратегії послідовних тестувань для подальшої
розробки відповідних експериментальних даних. Для речовин, які не
мають історії тестувань, необхідно використовувати стратегію
послідовних досліджень для оцінки роз'їдання/подразнення очей.
Стратегію тестувань, описану в цьому Додатку, було розроблено на
семінарі ОЕСР (1). Вона була затверджена і доповнена в
Гармонізованій інтегрованій системі класифікації загроз здоров'ю
людини, спричинених хімічними речовинами, та їх впливом на
навколишнє середовище, що було підтверджено на 28-му спільному
засіданні Комітету Хіміків і Робочої Групи Хіміків у листопаді
1998 року (2).
Хоча ця стратегія досліджень не є складовою частиною методу
тестування B.5, вона виражає рекомендований підхід до визначення
властивостей подразнення/роз'їдання ока. Цей підхід являє собою як
найкраще практичне втілення, так і етичний критерій для проведення
випробувань подразнення/роз'їдання ока in vivo. Метод випробування
надає інструкції щодо проведення випробування in vivo і підсумовує
фактори, на які слід звернути увагу перед розглядом такого
випробування. Стратегія послідовних випробувань забезпечує підхід
з точки зору вагомих доказів до оцінки існуючих даних щодо
властивостей подразнення/роз'їдання ока речовинами і поступовий
підхід до генерації відповідних даних, для яких потрібні додаткові
дослідження або щодо яких не проводилося досліджень. Стратегія
включає в себе спочатку застосування затверджених і прийнятих
випробувань in vitro або ex vivo, а потім метод випробування B.4,
дослідження подразнення/роз'їдання шкіри за специфічних
умов (3)(4).
ОПИС ПОЕТАПНОГО ПІДХОДУ ДО ДОСЛІДЖЕННЯ
Перш ніж проводити випробування як складову частину стратегії
послідовних випробувань (малюнок), необхідно оцінити всю наявну
інформацію з метою визначення необхідності в випробуванні на оці
in vivo. Хоча важливу інформацію можна отримати з оцінки одиничних
параметрів (наприклад, максимальний pH), необхідно оцінити
сукупність наявної інформації. Всі релевантні дані щодо впливів
досліджуваної речовини та її структурних аналогів необхідно
оцінювати при прийнятті рішення про вагомість доказів, а також
необхідно навести обґрунтування цього рішення. Особливий наголос
необхідно зробити на існуванні даних про вплив речовини на людину
і на тварину, результатом чого буде проведення дослідження
in vitro або ex vivo. За можливості, слід уникати досліджень
корозійних речовин in vivo. Фактори, що беруться до уваги в
стратегії випробувань, включають:
Оцінку існуючих даних щодо людини і тварини (Крок 1). Існуючі
дані щодо людини, наприклад, клінічні та професійні дослідження, а
також судові звіти та/або дані про випробування на тваринах з
досліджень ока слід розглядати в першу чергу, тому що вони надають
інформацію, що стосується безпосередньо впливу на очі. Надалі
необхідно оцінити дані, наявні з досліджень на людях та/або
тваринах, що вивчають роз'їдання/подразнення шкіри. Речовини з
відомим ступенем роз'їдаючої активності або сильним подразнюючим
впливом на очі не слід ні вводити в очі тваринам, ні наносити
речовини, що мають роз'їдаючий або подразнюючий вплив на шкіру,
такі речовини слід вважати роз'їдаючими та/чи подразнюючими.
Речовини, щодо яких вже отримано достатньо доказів відсутності
роз'їдання та подразнення в ході попередніх досліджень на оці, не
потрібно випробовувати за допомогою досліджень на оці in vivo.
Аналіз відносин структурної активності (ВСА) (Крок 2)
Результати випробувань структурно пов'язаних хімікатів мають
розглядатися за наявності. За наявності достатньої кількості даних
щодо досліджень впливу структурно пов'язаних речовин або суміші
таких речовин на людину та/або тварину, що показує їх потенціал
роз'їдання/подразнення ока, можна припустити, що досліджувана
речовина спровокує такі самі реакції. В таких випадках немає
необхідності у випробуванні речовини. Негативні дані, отримані в
ході досліджень структурно подібних речовин або суміші таких
речовин, не є достатнім доказом відсутності
роз'їдаючої/подразнюючої активності речовини згідно стратегії
послідовних випробувань. Для визначення потенціалу впливу
подразнення та роз'їдання як шкіри, так і очей, слід
використовувати підходи, затверджені і прийняті ВСА.
Фізико-хімічні властивості та хімічна реактивність (Крок 3).
Речовини, що виявляють екстремальний рівень pH, такий як <= 2,0
або >= 11,5, можуть мати сильний локальний вплив. Якщо
екстремальний рівень pH є підґрунтям для ідентифікації речовини як
роз'їдаючої або подразнюючої око, то її кислотний/лужний резерв
(здатність до буферизації) також можна брати до уваги (5)(6). Якщо
здатність до буферизації дозволяє зробити припущення, що речовина
може не бути роз'їдаючою для ока, на підтвердження цього необхідно
провести подальші дослідження; перевага надається використанню
затверджених і прийнятих досліджень in vitro або ex vivo (див.
Розділи Крок 5 та 6).
Розгляд іншої існуючої інформації (Крок 4). На цьому етапі
необхідно оцінити всю наявну інформацію щодо системної токсичності
через шкіру. Гостру шкірну токсичність досліджуваної речовини
також необхідно брати до уваги. Якщо досліджувана речовина
виявилася дуже токсичною для шкіри, її не потрібно випробовувати
на оці. Хоча не обов'язково існує зв'язок між токсичністю для
шкіри та подразненням/роз'їданням ока, можна припустити, що, якщо
реагент є дуже токсичним для шкіри, він також виявлятиме високу
токсичність при введенні в око. Ці дані також необхідно брати до
уваги між Кроками 2 та 3.
Результати випробувань in vitro або ex vivo (Кроки 5 та 6).
Речовини, які виявили роз'їдаючі або сильні подразнюючі
властивості під час випробувань in vitro або ex vivo (7)(8), та
були затверджені і прийняті для оцінки саме роз'їдаючої
активності/подразнення для очей або шкіри, не слід випробувати на
тваринах. Можна припустити, що досліджувана речовина матиме
подібні сильні впливи in vivo. За відсутності затверджених і
прийнятих до оцінки досліджень in vitro/ex vivo, слід пропустити
Кроки 5 та 6, і переходити одразу до Кроку 7.
Оцінка потенціалу речовини викликати подразнення або
роз'їдання (Крок 7). Якщо існує недостатньо доказів, що базуються
на вищезазначених дослідженнях, для здійснення підсумкового
аналізу вагомих доказів потенційного подразнюючого/роз'їдаючого
впливу речовини на очі, спочатку слід оцінити потенціал
подразнення/роз'їдання шкіри in vivo, використовуючи метод
випробування B.4 (4) і супроводжуючий Додаток (9). Якщо виявилося,
що речовина спричиняє роз'їдання або сильне подразнення шкіри, її
слід вважати роз'їдаючою і подразнюючою око, якщо інша інформація
не підтверджує альтернативного висновку. Таким чином, може не бути
потреби в проведенні досліджень на оці in vivo. Якщо речовина не є
роз'їдаючою або сильно подразнюючою для шкіри, необхідно здійснити
дослідження на оці in vivo.
Випробування in vivo на кроликах (Кроки 8 та 9): Дослідження
на оці in vivo слід починати з використанням однієї тварини. Якщо
результати випробування показують, що речовина є роз'їдаючою або
викликає сильне подразнення ока, подальші дослідження
подразнюваності ока необхідно припинити. Якщо це випробування не
виявило роз'їдаючого або сильного подразнюючого ефекту,
проводиться підтверджувальне випробування з використанням двох
додаткових тварин.
ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report
of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance
Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in
Solna, Sweden, 22-24 January 1996
(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(2) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical
Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998
(http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H., (1999). A General Approach
for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, p. 161-177.
(4) Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal
irritation/corrosion.
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H.,
(1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of
Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without
Testing on Animals. Toxicolohy In Vitro, 27, p. 19-26.
(6) Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the Eye
Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J.
Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A.,
Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and
Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on in
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the
Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
(8) Testing Method B.40 Skin Corrosion.
(9) Appendix to Testing method B.4: A Sequential Testing
Strategy for Skin Irritation and Corrosion.

Малюнок
ДОСЛІДЖЕННЯ І СТРАТЕГІЯ ОЦІНЮВАННЯ
ПОДРАЗНЕННЯ/РОЗ'ЇДАННЯ ОКА

Вид діяльності Отриманий Висновок
--------------------- 1 |Існуючі дані про | Серйозні ушкодження Максимальне граничне значення; |впливи на очі | очей вважати роз'їдаючою для очей. |людини та/або | Дослідження непотрібні. |тварини | | | Подразнююча для ока Максимальне граничне значення; | | вважати подразнюючою для очей. | | Дослідження непотрібні. | | | | Не роз'їдає/не Максимальне граничне значення; | | подразнює око вважати не роз'їдаючою/не | | подразнюючою для очей. | | Дослідження не вимагаються. | | |Існуючі дані про | Роз'їдає шкіру Припускаємо роз'їдаючу |роз'їдаючі впливи | активність щодо очей. |на шкіру людини | Дослідження непотрібні. |та/або тварини | | | |Існуючі дані про | Сильно подразнює Припускаємо подразнюючу |сильні подразнюючі | шкіру активність щодо очей. |впливи на шкіру | Дослідження непотрібні. |людини та/або | |тварини | --------------------- | \/
немає доступної інформації, або
доступна інформація непереконлива
| | \/ --------------------- 2 |Продемонструвати | Передбачаються Припускаємо роз'їдаючу |ВСА для | серйозні ушкодження активність щодо очей. |роз'їдання/ | очей Дослідження непотрібні. |подразнення очей | | | | | Передбачаються Припускаємо подразнюючу | | подразнення очей. активність щодо очей. | | Дослідження непотрібні. | | | | |Продемонструвати | Передбачається Припускаємо роз'їдаючу |ВСА для роз'їдання | роз'їдання шкіри активність щодо очей. |шкіри | Дослідження непотрібні. --------------------- \/
Неможливо зробити припущення, або припущення не є переконливими чи є негативними
| \/ --------------------- 3 |Виміряти pH | pH <= 2 або >= 11,5 Припускаємо роз'їдаючу |(здатність до | (з високою здатністю активність щодо очей. |буферизації, за | до буферизації, Дослідження непотрібні. |необхідності) | якщо потрібно) --------------------- | \/
2 < pH < 11,5, або pH <= 2,0 або >= 11,5 з відсутньою/низькою здатністю до буферизації, за необхідності
| | \/ --------------------- 4 |Оцінити системну | Дуже токсична в Речовина була б дуже |токсичність через | концентраціях, що токсичною для досліджень |вплив на шкіру | використовувалися б на очах. --------------------- для досліджень на оці Дослідження непотрібні. | \/
Така інформація недоступна, або речовина не дуже токсичною
| \/ --------------------- 5 |Виконати | Реакція роз'їдання Припускаємо роз'їдаючу |затверджене і | активність щодо очей. |прийняте | Дослідження непотрібні. |дослідження | |роз'їдання очей in | |vitro або ex vivo. | --------------------- | \/
Речовина не роз'їдаюча, або затверджені методи досліджень роз'їдання очей in vitro або ex vivo не є доступними.
| | \/ --------------------- 6 |Виконати | Реакція подразнення Припускаємо подразнюючу |затверджене і | активність щодо очей. |прийняте | Подальші дослідження |дослідження | непотрібні |подразнення очей | |in vitro або | |ex vivo. | --------------------- | \/
Речовина не подразнююча, або затверджені методи досліджень роз'їдання очей in vitro або ex vivo не є доступними
| \/ --------------------- 7 |Експериментально | Реакція роз'їдання Припускаємо роз'їдаючу |оцінити потенціал | або сильного активність щодо очей. |подразнення/ | подразнення Подальші дослідження |роз'їдання шкіри | непотрібні. |in vivo (див. метод| |дослідження В.4, | |включаючи Додаток) | --------------------- | \/
Речовина не є роз'їдаючою або не викликає сильних подразнень шкіри
| \/ --------------------- 8 |Виконати початкове | Сильні ушкодження Вважаємо роз'їдаючою |дослідження на оці | очей для очей. Подальші |кролика in vivo з | дослідження непотрібні. |використанням | |однієї тварини | --------------------- | \/
Немає значних ушкоджень або відсутня реакція
| | \/ --------------------- 9 |Виконати | Роз'їдаюча або Вважаємо роз'їдаючою |підтверджувальне | подразнююча. або подразнюючою для очей. |дослідження з | Подальші дослідження |використанням | непотрібні. |однієї або двох | |додаткових тварин | Не роз'їдаюча або Вважаємо не роз'їдаючою або --------------------- не подразнююча. не подразнюючою для очей. Подальші дослідження непотрібні.

B.6. СЕНСИБІЛІЗАЦІЯ ШКІРИ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Зауваження
Чутливість і можливість проведення досліджень для визначення
можливих сенсибілізаторів людської шкіри вважаються важливими в
системі класифікації токсичності по відношенню до здоров'я людини.
Немає єдиного методу дослідження, який би адекватно визначав
всі речовини з потенціалом сенсибілізації людської шкіри і
підходив би для всіх речовин.
Такі фактори, як фізичні властивості речовини, включаючи її
здатність проникати крізь шкіру, слід враховувати при виборі
дослідження. Було розроблено два види досліджень з використанням
морських свинок: випробування на тип ад'юванту, під час якого
алергічний стан підсилюється розчиненням чи заміною досліджуваної
речовини на повний ад'ювант Фрейнда (ПАФ), та неад'ювантні
випробування.
Випробування на тип ад'юванту можуть бути більш точними в
передбаченні можливого сенсибілізаційного ефекту на шкіру людини,
спричиненого речовиною, ніж методи без використання повного
ад'юванту Фрейнда, та їм, таким чином, надається перевага.
Тест на максимізацію морських свинок (ТММС) є широко
використовуваним випробуванням на тип ад'юванту. Хоча для
визначення потенціалу речовини викликати реакцію сенсибілізації
шкіри використовується декілька інших методів, ТММС вважається
кращою ад'ювантною технікою.
За наявності багатьох класів хімічних речовин неад'ювантні
випробування (одним з кращих вважається тест Бюхлера) вважаються
менш чутливими.
В певних випадках можуть бути підстави для вибору тесту
Бюхлера з для місцевого застосування, а не інтрадермальна
ін'єкція, що використовується для тесту на максимізацію морських
свинок. Для використання тесту Бюхлера потрібно надавати наукове
обґрунтування.
Тест на максимізацію морських свинок (ТММС) та тест Бюхлера
описані в цьому методі. Можливе використання інших методів за
умови, якщо вони є затвердженими і науково обґрунтованими.
Якщо в ході офіційно визнаного скринінг-тесту отримано
позитивний результат, досліджувана речовина може бути позначена як
потенційний сенсибілізатор, і проведення подальших випробувань на
морських свинках не буде необхідним. Проте, якщо результати
випробування негативні, випробування на морських свинках необхідно
проводити, використовуючи процедуру, описану в цьому методі
досліджень.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Сенсибілізація шкіри: (алергічний контактний дерматит)
імунологічно опосередкована реакція шкіри на речовину. У людини
реакції можуть бути виражені наступним чином: свербінням,
еритемою, набряком, папулами, пухирцями, здуттями або поєднанням
цих проявів. У інших біологічних видів реакції можуть
відрізнятися, і може проявитися тільки еритема та набряк.
Піддавання впливу індукції: експериментальне піддавання
об'єкта впливу досліджуваної речовини з наміром спровокувати
надчутливий стан.
Період індукції: період тривалістю принаймні один тиждень
після піддавання впливу індукції, впродовж якого може розвиватися
надчутливий стан.
Піддавання впливу провокаційної проби: експериментальне
піддавання попередньо розглянутого об'єкту впливу досліджуваної
речовини після періоду індукції з метою визначення того, чи
виникає в об'єкта реакція гіперчутливості.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Чутливість і надійність використаної експериментальної
техніки слід оцінювати кожні шість місяців шляхом використання
речовин, відомих своїми м'якими або помірними властивостями
сенсибілізації шкіри.
Якщо тест проведено правильно, для м'яких/помірних
сенсибілізаторів очікується реакція принаймні 30% при ад'ювантному
дослідженні і принаймні 15% при неад'ювантному дослідженні.
Перевага надається наступним речовинам.
-------------------------------------------------------------------------------- |Номери РСХ|Номери ЄРІКХР| Назви ЄРІКХР | Загальноприйняті назви | |----------+-------------+--------------------------+--------------------------| | 101-86-0 | 202-983-3 |альфа-гексилсиннамальдегід|альфа-гексилсиннамальдегід| |----------+-------------+--------------------------+--------------------------| | 149-30-4 | 205-736-8 | Бензотіазол-2-тіол | каптакс | | | | (меркатобензотіазол) | | |----------+-------------+--------------------------+--------------------------| | 94-09-7 | 202-303-5 | Бензокаїн | норкаїн | --------------------------------------------------------------------------------
Є обставини, за яких, при умові відповідного обґрунтування,
можуть використовуватись інші контрольні речовини, що відповідають
вищенаведеним критеріям.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕНЬ
Піддослідні тварини спочатку піддаються впливу досліджуваної
речовини шляхом інтрадермальної ін'єкції та/або епідермального
застосування (піддавання впливу індукції). Після періоду
відпочинку від 10 до 14 днів (періоду індукції), під час якого
може проявитися імунна реакція, тварині вводиться доза
провокаційної проби. Міра і ступінь реакції шкіри на піддавання
впливу провокаційної проби у піддослідних тварин порівнюється з
реакціями, що виявилися у контрольної групи тварин, що піддавалися
симулятивному лікуванню під час індукції і отримали провокаційну
пробу.
1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕНЬ
Якщо вважається необхідним усунення досліджуваної речовини,
це необхідно зробити, використовуючи воду чи відповідний розчинник
без видозмін існуючої реакції або цілісності епідермісу.
1.5.1. Тест на максимізацію морських свинок (ТММС)
1.5.1.1. Підготовка
Здорових молодих дорослих альбіносів морських свинок
адаптують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів
перед тестом проведенням тесту. Перед тестом тварин відбирають
методом рандомізації і призначають в певну групу. Хутро видаляють
шляхом підстригання, гоління або хімічної епіляції, в залежності
від використаного методу дослідження. Необхідно подбати про те,
щоб уникнути потертості шкіри. Тварин зважують до початку тесту та
після його завершення.
1.5.1.2. Умови проведення тесту
1.5.1.2.1. Піддослідні тварини:
Зазвичай використовуються лабораторні види альбіносів
морських свинок.
1.5.1.2.2. Кількість і стать
Можливе використання тварин чоловічої та/або жіночої статі.
Якщо використовуються тварини жіночої статі, вони мають бути не
вагітними і такими, що ніколи не народжували.
Використовується мінімум 10 тварин у піддослідній групі і
щонайменше п'ять тварин в контрольній групі. Якщо для проведення
тесту було використано менш ніж 20 морських свинок у піддослідній
групі і менш ніж 10 - у контрольній, і висновок про те, що
досліджувана речовина є сенсибілізатором, зробити неможливо,
наполегливо рекомендується проведення тестування на додаткових
тваринах в кількості щонайменше 20 тварин у піддослідній групі і
10 - у контрольній.
1.5.1.2.3. Рівні дозування
Концентрація досліджуваної речовини, використаної для кожного
піддавання впливу індукції, має систематично добре переноситися і
має бути найвищою для спричинення м'якого або помірного
подразнення шкіри. Концентрація, використана для піддавання впливу
провокаційної проби, має складати найвищу дозу, яка не викликає
подразнення. У випадку відсутності іншої інформації відповідні
концентрації слід визначати за допомогою пілотного дослідження з
використанням двох або трьох тварин. З цією метою слід вирішити
питання про використання тварин, які піддавалися впливу ПАФ.
1.5.1.3. Процедура
1.5.1.3.1. Індукція
0-й день - піддослідна група
Робиться три пари інтрадермальних ін'єкцій об'ємом 0,1 мл в
плечову зону, очищену від хутра таким чином, що кожна пара
розташована по кожній стороні середньої лінії.
Ін'єкція 1: суміш 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/вода
або фізіологічний розчин.
Ін'єкція 2: Досліджувана речовина з відповідним розчинником у
вибраній концентрації.
Ін'єкція 3: Досліджувана речовина у вибраній концентрації,
складеній в пропорції 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/вода
або фізіологічний розчин.
Для ін'єкції 3 розчинні в воді речовини розчиняються у водній
фазі перед змішуванням з ПАФ. Жиророзчинні або нерозчинні речовини
усуваються з ПАФ перед поєднанням з водною фазою. Остаточна
концентрація досліджуваної речовини повинна дорівнювати
концентрації, що була використана для ін'єкції 2.
Ін'єкції 1 та 2 робляться поряд одна з одною і якомога ближче
до голови, в той час, як третя робиться біля хвостової частини
зони тестування.
0-й день - контрольна група
Робиться три пари інтрадермальних ін'єкцій об'ємом 0,1 мл в
ту ж саму зону, що й у тварин піддослідної групи.
Ін'єкція 1: суміш 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/вода
або фізіологічний розчин.
Ін'єкція 2: нерозбавлений розчинник.
Ін'єкція 3: 50% розчинника по відношенню ваги до об'єму в
суміші 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/вода або фізіологічний
розчин.
Дні 5-7 - піддослідна та контрольна групи
Приблизно за 24 години до місцевого застосування індукції,
якщо речовина не подразнює шкіру, зона випробувань, після
підстригання коротко та/або гоління хутра обробляється 0,5 мл
розчиненого у вазеліні 10%-го лаурилсульфату соди для створення
місцевої реакції подразнення.
6-й - 8-й день - піддослідна група
У зоні тестування знову видаляється хутро. Фільтрувальний
папір (2 х 4 см) повністю заповнюється досліджуваною речовиною з
відповідним розчинником і застосовується до зони дослідження, і
далі утримується в контакті за допомогою оклюзійної пов'язки
протягом 48 годин. Вибір розчинника має бути обґрунтованим. Тверді
речовини подрібнюються в порошок і поміщаються у відповідний
розчинник. Рідини можуть застосовуватись нерозбавленими, якщо це є
доцільним.
6-й - 8-й день - контрольна група
У зоні тестування знову видаляється хутро. Розчинник
застосовується подібним чином до зони дослідження, і далі
утримується в контакті за допомогою оклюзійної пов'язки протягом
48 годин.
1.5.1.3.2. Провокаційна проба
Дні 20-22 - піддослідна та контрольна групи
З боків тварин з піддослідної та контрольної групи
видаляється хутро. Латка або камера, наповнена досліджуваною
речовиною, прикладається до одного боку тварини і, якщо потрібно,
латка або камера, наповнена тільки розчинником, також може
прикладатися до іншого боку. Латки утримуються в контакті за
допомогою оклюзійної пов'язки протягом 24 годин.
1.5.1.3.3. Спостереження і класифікація: піддослідна та
контрольна групи
- приблизно через 21 годину після усунення латки, зона
провокаційної проби очищується і коротко обстригається та/або
голиться, та за необхідності проводиться її епіляція;
- приблизно через три години після цього (приблизно через
48 годин від початку проведення провокаційної проби)
спостерігається реакція шкіри, яка фіксується згідно з
класифікацією, наведеною у Додатку;
- приблизно через 24 години після цього спостереження
проводиться наступне спостереження (72 години), яке знову
фіксується.
Схвалюється застосування методу сліпого зчитування даних про
тварин з піддослідної та контрольної групи.
Якщо необхідно прояснити результати, отримані після
проведення першої провокаційної проби, можливий варіант проведення
другої провокаційної проби (так званої повторної проби), за
необхідності, з використанням нової контрольної групи, приблизно
через тиждень після проведення першої проби. Повторна проба також
може проводитися на первісній контрольній групі.
Всі реакції шкіри і будь-які незвичні відчуття, включаючи
системні реакції, що є результатом індукції і процедури проведення
провокаційної проби необхідно спостерігати і фіксувати згідно
класифікаційної шкали Магнуссона/Клігмана (див. Додаток). Для
прояснення сумнівних реакцій можуть проводитися інші процедури,
наприклад, гістопатологічне дослідження, вимірювання товщини
шкірної складки.
1.5.2. Тест Бюхлера
1.5.2.1. Підготовка
Здорових молодих дорослих альбіносів морських свинок
адаптують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів
перед проведенням тесту. Перед проведенням тесту тварин відбирають
методом рандомізації і призначають в певну групу. Хутро видаляють
шляхом підстригання, гоління або хімічної епіляції, в залежності
від використаного методу дослідження. Необхідно подбати про те,
щоб уникнути потертості шкіри. Тварин зважують до початку тесту та
після його завершення.
1.5.2.2. Умови проведення тесту
1.5.2.2.1. Піддослідні тварини:
Зазвичай використовуються лабораторні види альбіносів
морських свинок.
1.5.2.2.2. Кількість і стать
Можливе використання тварин чоловічої та/або жіночої статі.
Якщо використовуються тварини жіночої статі, вони мають бути не
вагітними і такими, що ніколи не народжували.
Використовується мінімум 20 тварин в піддослідній групі і
щонайменше 10 тварин в контрольній групі.
1.5.2.2.3. Рівні дозування
Концентрація досліджуваної речовини, використаної для кожного
піддавання впливу індукції, має бути найвищою з можливих для того,
щоб викликати м'яке але не надмірне подразнення. Концентрація,
використана для піддавання впливу провокаційної проби, має
складати найвищу не подразнюючу дозу. За необхідності відповідну
концентрацію можна визначати за допомогою пілотного дослідження з
використанням двох або трьох тварин.
Для розчинних в воді досліджуваних матеріалів слід
використовувати воду або розбавлений не подразнюючий розчин ПАР в
якості розчинника. Для інших досліджуваних матеріалів надається
перевага використанню 80% етанолу/води для індукції і ацетону для
провокаційної проби.
1.5.2.3. Процедура
1.5.2.3.1. Індукція
0-й день - піддослідна група
Один бік очищується від хутра (коротко обстригається).
Система латок для випробування має бути повністю наповнена
досліджуваною речовиною із відповідним розчинником (вибір
розчинника має бути виправданим; рідкі досліджувані речовини
можуть використовуватися нерозбавленими, якщо це є доцільним).
Система латок для випробування прикріплюється до зони
дослідження, і далі утримується в контакті за допомогою оклюзійної
латки або камери та відповідної пов'язки протягом шести годин.
Система латок для випробування повинна бути оклюзійною.
Підходить бавовняна підкладка, яка може бути круглою або
квадратною, розміром приблизно 4-6 кв.см. Перевага надається
пристосуванню для стримування з використанням відповідного
фіксатора з метою забезпечення оклюзії. Якщо використовується
обгортання, є можливість виникнення потреби в додатковому впливі.
0-й день - контрольна група
Один бік очищується від хутра (коротко обстригається). Тільки
розчинник застосовується в подібний до використаного для
піддослідної групи спосіб. Система латок для випробування
прикріплюється до шкіри за допомогою оклюзійної латки або камери
та відповідної пов'язки на шість годин. Якщо є можливість
виявлення відсутності потреби в симулятивній контрольній групі,
можна використати незаражену контрольну групу.
Дні 6-8 та 13-15 - піддослідна та контрольна групи
Те ж саме застосування, як і в 0-й день, проводиться в тій же
зоні дослідження (очищеній від хутра, якщо необхідно) того ж плеча
на 6-8-й день та знову на 13-15-й день.
1.5.2.3.2 Провокаційна проба
Дні 27-29 - піддослідна та контрольна групи
Не використовувані раніше боки тварин з піддослідної та
контрольної групи очищуються від хутра (коротко обстригаються).
Оклюзійна латка або камера, що містить відповідну кількість
досліджуваної речовини у максимальній не подразнюючій
концентрації, прикладається до задніх частин не використовуваних
раніше боків тварин з піддослідної та контрольної групи.
При потребі оклюзійна латка або камера тільки з розчинником
прикладається до передніх частин не використовуваних раніше боків
тварин з піддослідної та контрольної групи. Латки або камери
утримуються в контакті за допомогою відповідної пов'язки протягом
шести годин.
1.5.2.3.3. Спостереження і класифікація
- приблизно через 21 годину після усунення латки зона
провокаційної проби очищується від хутра,
- приблизно через три години після цього (приблизно через
30 годин від прикладення латки для проведення провокаційної проби)
спостерігається реакція шкіри, яка фіксується згідно з
класифікацією, наведеною у Додатку,
- приблизно через 24 години після 30-годинного спостереження
(приблизно через 54 години від прикладення латки для проведення
провокаційної проби) знов спостерігається і фіксується реакція
шкіри.
Заохочується сліпе зчитування даних про тварин з піддослідної
та контрольної групи.
Якщо необхідно з'ясувати результати, отримані після
проведення першої провокаційної проби, можливий варіант проведення
другої провокаційної проби (так званої повторної проби), за
необхідності, з використанням нової контрольної групи, приблизно
через тиждень після першої. Повторна проба також може проводитися
на первісній контрольній групі.
Всі реакції шкіри і будь-які незвичні відчуття, включаючи
системні реакції, що є результатом індукції і процедури проведення
провокаційної проби, потрібно спостерігати і фіксувати згідно
класифікаційної шкали Магнуссона/Клігмана (див. Додаток). Для
з'ясування сумнівних реакцій можуть проводитися інші процедури,
наприклад, гістопатологічне дослідження, вимірювання товщини
шкірної складки.
2. ДАНІ (ТММС та тест Бюхлера)
Дані повинні бути підсумовані у формі таблиці, де зазначені
шкірні реакції кожної тварини при кожному спостереженні.
3. ЗВІТНІСТЬ (ТММС та тест Бюхлера)
Якщо скринінг-аналіз виконано перед проведенням дослідження
на морських свинках, необхідно надати опис або посилання на
дослідження (наприклад, Тест на набухання вух мишей (ТНВМ)),
включаючи докладну інформацію про процедури, разом з отриманими
результатами щодо досліджуваних і еталонних речовин.
Звіт щодо проведеного дослідження (тммс та тест Бюхлера)
За можливості, звіт щодо проведеного дослідження має містити
наступну інформацію:
Піддослідні тварини:
- використана лінія морських свинок
- кількість, вік і стать тварин
- походження, умови утримання, дієта, і т.д.
- вага кожної тварини на початку дослідження.
Умови проведення дослідження:
- техніка підготовки місця для прикладення латки,
- докладна інформація щодо використаних матеріалів для латок
і техніки прикріплення латок,
- результат пілотного дослідження з висновком про
концентрацію речовин для індукції та провокаційної проби, що мають
використовуватись для дослідження,
- докладна інформація щодо приготування, прикладення і
усунення досліджуваної речовини,
- обґрунтування вибору розчинника.
- концентрація розчинника і досліджуваної речовини для
індукції та піддавання впливу провокаційної проби і загальна
кількість речовини, застосованої для індукції та провокаційної
проби.
Результати:
- зведена інформація про результати останньої перевірки на
чутливість і надійність (див. пункт 1.3), включаючи інформацію
щодо речовини, її концентрації та використаного розчинника,
- на кожну тварину, включаючи класифікацію,
- нарративний опис ступеню і природи реакцій, які
спостерігалися,
- будь-які гістопатологічні показники.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
Цей метод аналогічний методу, описаному у ТІ ОЕСР 406.

Додаток

ТАБЛИЦЯ
Класифікаційна шкала Магнуссона/Клігмана
для оцінки реакцій при проведенні дослідження
з використанням латок для провокаційної проби
0 = немає видимих змін
1 = дискретна або фрагментарна еритема
2 = помірна еритема та конфлюентна еритема
3 = гостра еритема та пухлина

B.7. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ
(ЯКА ВВОДИТЬСЯ ПЕРОРАЛЬНО ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Досліджувана речовина вводиться щоденно пероральним шляхом
градуйованими дозами кільком групам піддослідних тварин, один
рівень доз для однієї групи протягом 28 днів. Протягом періоду
застосування за тваринами ведеться ретельне щоденне спостереження
з метою виявлення ознак токсичності. Проводиться розтин тварин,
які помирають або знищуються під час дослідження, а по завершенні
дослідження проводиться знищення тварин, що вижили, і подальший їх
розтин.
Цей метод робить більший наголос на виявленні неврологічного
впливу, як кінцевої мети дослідження, і на потребі ретельних
клінічних спостережень за тваринами з метою отримання якомога
більшої кількості інформації. Метод має визначити хімічні
препарати з нейротоксичним потенціалом, що надасть підстави для
подальших поглиблених досліджень в цьому напрямку. Окрім того, цей
метод може виявити симптоми імунологічних впливів та токсичності
щодо репродуктивних органів.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка
Здорових молодих дорослих тварин із застосуванням випадкового
відбору призначають в піддослідну групу. Клітки мають
розташовуватись таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи їх
місця розташування. Тварини ідентифікуються окремо і поміщаються в
клітках щонайменше на 5 днів до початку проведення дослідження з
метою їх пристосування до лабораторних умов.
Досліджувана речовина вводиться через зонд, з їжею або питною
водою. Метод перорального введення залежить від мети дослідження
та фізичних/хімічних властивостей речовини.
За необхідності, досліджувана речовина розчиняється у
відповідному розчиннику або усувається з його використанням.
Рекомендується там, де можливо, використовувати спочатку водний
розчин/суспензію, потім розглянути варіант використання
розчину/емульсії олії (наприклад, кукурудзяної олії), далі -
можливість розчинення в інших розчинниках. При використанні
будь-якого розчинника, окрім води, слід враховувати токсичні
характеристики розчинника. Необхідно визначити стабільність
досліджуваної речовини в розчиннику.
1.4.2. Умови проведення дослідження:
1.4.2.1. Піддослідні тварини:
Перевага при виборі з біологічних видів гризунів надається
щуру, хоча можливе використання інших біологічних видів гризунів.
Слід залучити випробувань до дослідження лабораторні лінії
здорових молодих дорослих тварин, що зазвичай використовуються.
Тварини жіночої статі мають бути не вагітними і такими, що ніколи
не народжували. Дози слід починати давати як можна раніше після
закінчення вигодовування материнським молоком і, в будь-якому
випадку, до того, як тварині виповниться 9 тижнів.
На початку дослідження коливання ваги тварин має бути
мінімальним і не перевищувати +- 20% від середньої ваги для кожної
статі.
Коли дослідження щодо перорального введення повторюваної дози
проводиться як підготовче до тривалого дослідження, перевага
надається використанню тварин з однієї лінії і одного походження
для обох досліджень.
1.4.2.2. Кількість і стать
Щонайменше 10 тварин (п'ять самців і п'ять самок) потрібно
використовувати для кожного рівня доз. Якщо заплановане проміжне
знищення тварин, їх кількість слід збільшити на кількість тварин,
яких планується знищити до завершення дослідження.
Окрім того, супутній групі з 10 тварин (по 5 тварин кожної
статі) може вводитися найвища доза протягом 28 днів, а також
проводяться спостереження щодо зворотності, витривалості або
відстроченої ймовірності токсичного впливу впродовж 14 днів після
введення речовини. Також використовується супутня група з
10 контрольних тварин (по 5 тварин кожної статі).
1.4.2.3. Рівень дозування
Зазвичай слід використовувати три піддослідних і одну
контрольну групу. За винятком введення досліджуваної речовини, за
тваринами в контрольній групі доглядають так само, як і за
тваринами піддослідної групи. Якщо при введенні досліджуваної
речовини використовується розчинник, контрольна група має
отримувати розчинник в максимальному об'ємі, що використовувався.
Якщо згідно з оцінками або іншими даними не очікується ефекту
від дози в 1000 мг/кг маси тіла/на день, можливе проведення
дослідження на граничний вміст. Якщо немає наявних відповідних
даних, можливе проведення дальнометричного дослідження з метою
визначення використовуваних доз.
Рівні дозування слід добирати, враховуючи будь які існуючі
наявні дані про токсичність та (токсико-) кінетичні дані щодо
досліджуваної речовини або пов'язаних з нею матеріалів. Найвищу
дозу слід обирати з метою стимуляції токсичних впливів, але не
смерті або сильних страждань. Надалі потрібно обрати низхідну
послідовність рівнів дозування з метою виявлення будь-якої
реакції, пов'язаної з дозуванням, та шкідливі для здоров'я впливи,
що не спостерігалися, при застосуванні найнижчого рівня дозування.
Часто оптимальним є використання від 2 до 4 інтервалів для
встановлення низхідних рівнів дозування, і часто надається
перевага додаванню четвертої піддослідної групи перед
використанням дуже великих інтервалів (наприклад, більше, ніж
фактор 10) між введенням доз.
Для речовин, які вводяться з їжею або питною водою, важливо
забезпечити, щоб введена кількість досліджуваної речовини не
впливала на звичайний процес харчування або водний баланс. Коли
досліджувана речовина вводиться з їжею, можливе використання або
постійної концентрації їжі (в мільйонних долях), або постійного
рівня дозування відповідно до ваги тварини, при використанні
альтернативних варіантів їх потрібно вказати. Коли досліджувана
речовина вводиться з їжею, дозу слід вводити в один і той самий
час кожного дня, і, якщо потрібно, вивірити умови для підтримання
постійного рівня дозування відповідно до ваги тварини.
Коли дослідження щодо введення повторюваної дози проводиться
як підготовче до тривалого дослідження, для обох досліджень слід
використовувати однакове харчування.
1.4.2.4. Випробування на граничний вміст
Якщо випробування на одному рівні дозування, який становить
щонайменше 1000 мг/кг маси тіла/на день або, для введення з їжею
або питною водою, еквівалентне співвідношення з їжею або питною
водою (що засновується на визначеннях маси тіла) при використанні
процедур, визначених для цього дослідження, не спричиняє токсичних
впливів, і якщо токсичність не передбачається з огляду на дані
щодо структурно подібних речовин, то можливо, не виникне
необхідності в проведенні розширеного дослідження з використанням
трьох рівнів дозування. Випробування на граничний вміст
застосовується у всіх випадках, крім тих, де вплив на людину
визначає потребу в використанні вищого рівня дозування.
1.4.2.5. Період спостереження
Період спостереження має тривати 28 днів. Тваринам у супутній
групі, призначеним для подальшого спостереження, не слід нічого
вводити щонайменше протягом 14 днів для визначення відстроченого
впливу, витривалості чи відновлення після токсичних впливів.
1.4.3. Процедура
Досліджувана речовина вводиться тваринам щоденно протягом
28 днів, введення речовини в режимі 5 днів на тиждень має бути
виправданим. Коли досліджувана речовина вводиться з їжею, її
потрібно вводити тварині однією дозою, використовуючи зонд для
штучного харчування або відповідну інтубаційну трубку.
Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один раз, залежить від
розміру піддослідної тварини. Об'єм не має перевищувати 1 мл/100 г
маси тіла, за винятком використання водних розчинів, де можливо
використовувати 2 мл/100 г маси тіла. За винятком подразнюючих чи
роз'їдаючих речовин, які зазвичай виявляють ускладнені впливи при
більшій концентрації, коливання досліджуваного об'єму потрібно
мінімізувати шляхом пристосування концентрації до забезпечення
постійного об'єму на всіх рівнях дозування.
1.4.3.1. Загальні спостереження
Загальні клінічні спостереження слід здійснювати щонайменше
один раз на день, краще в той самий час щоденно, беручи до уваги
піковий період передбаченого впливу після введення дози. Стан
здоров'я тварин потрібно фіксувати. Щонайменше два рази на день
проводяться спостереження з метою виявлення захворюваності і
смертності тварин. Помираючі тварини та тварини що постійно
страждають, мають бути вилучені, як тільки цей факт помітять,
знищені гуманним способом і піддані розтину.
Один раз перед першим введенням (з метою проведення порівнянь
в межах об'єкта) і щонайменше раз на тиждень після нього,
необхідно проводити розгорнуті клінічні спостереження за всіма
тваринами. Ці спостереження потрібно здійснювати поза кліткою, де
утримується тварина на стандартному місці, бажано в один і той
самий час. Вони повинні детально фіксуватися, бажано з
використанням систем оцінювання, які легко можуть зрозуміти в
дослідній лабораторії. Потрібно прослідкувати за тим, щоб
коливання умов випробування були мінімальними і бажано, щоб
спостереження проводилось персоналом, що не знає про введення
речовини. Фіксувати потрібно зміни у шкірі, хутрі, очах, слизових
оболонках, впливі на секреторні та екскреторні функції, а також
автономній діяльності (наприклад, сльозовиділенні, пілоерекції,
розмірі зіниць, незвичні респіраторні явища). Зміни в ході,
поставі і реакції на догляд, так само, як наявність клонічних або
тонічних рухів, стереотипів (наприклад, надмірна чистка хутра,
періодично повторюване ходіння по колу) або дивна поведінка
(наприклад, самоушкодження, ходіння назад) мають також
фіксуватися.
На четвертий тиждень піддавання впливу потрібно провести
оцінку сенсорної реактивності на стимули різного типу (наприклад,
слухові, візуальні та пропріоцептивні імпульси); оцінку сили
захвату та моторної активності. Подальша докладна інформація щодо
процедур, які можуть проводитися після вищенаведених, розглянуто в
літературі (дивіться Загальний вступ, Частину B).
Функціональні спостереження, що проводяться на четвертий
тиждень піддавання впливу, можуть не проводитися, якщо дослідження
проводиться як підготовче до подальшого підгострого (90-денного)
дослідження. У цьому випадку, функціональні спостереження мають
включатися в це подальше дослідження. З іншого боку, наявність
даних функціональних спостережень з дослідження введення
повторюваної дози може надати можливість вибрати рівні дозування
для подальшого підгострого дослідження.
Функціональні спостереження можна також пропустити виключно
для груп, які іншим чином виявляють ознаки токсичності до такої
міри, що це може значно впливати на процес функціонального
випробування.
1.4.3.2. Маса тіла і споживання їжі/води
Всіх тварин зважують щонайменше один раз на тиждень.
Вимірювання споживання їжі і води слід проводити щонайменше один
раз на тиждень. Якщо досліджувана речовина вводиться з питною
водою, вимірювання споживання води необхідно проводити також
щонайменше один раз на тиждень.
1.4.3.3. Гематологія
Наступні гематологічні дослідження мають проводитися
наприкінці періоду дослідження: гематокрит, концентрація
гемоглобіну, підрахунок еритроцитів, загальний і диференціальний
підрахунок лейкоцитів, підрахунок тромбоцитів і вимірювання
часу/потенціалу згортання крові.
Зразки крові слід взяти з визначеного місця одразу перед або
під час процедури знищення тварин, і зберігати за відповідних
умов.
1.4.3.4. Клінічна біохімія
Клінічні біохімічні дослідження для виявлення найбільших
токсичних впливів на тканини і, особливо, впливів на нирки і
печінку, мають проводитися на зразках крові, отриманих від усіх
тварин (крім помираючих та/або знищених випадково) відразу перед
або під час процедури знищення тварин. Рекомендується не годувати
тварин вночі перед забором крові для зразків(1). При проведенні
дослідження плазми чи сироватки мають враховуватися показники
соди, калію, глюкози, загальної кількості холестерину, сечовини,
креатиніну, загальної кількості протеїнів та альбумінів,
щонайменше два визначення впливів показників ензимів або
гепатоцелюларних впливів (таких, як аланін-амінотрансфераза,
аспартат-амінотрансфераза, лужна фосфатаза,
гамма-глутамилтранспептидаза та сорбіт-дегідрогеназа). Вимірювання
додаткових ензимів (печінкового або іншого походження) та надлишку
жовчі може надати корисну інформацію за певних умов.
---------------- (1) Для кількісних вимірювань сироватки і плазми, особливо
стосовно глюкози, бажано не годувати тварин вночі перед забором
крові. Головною причиною цього є те, що підвищена варіативність,
що є неуникненним результатом годування тварин, може замаскувати
більш слабко виражені ефекти і ускладнити інтерпретацію. З іншого
боку, проте, якщо не годувати тварин вночі, це може змінити
загальний метаболізм тварини і, особливо при проведенні
досліджень, пов'язаних з годуванням, може порушити щоденне
введення досліджуваної речовини. Якщо було вирішено не годувати
тварин вночі, клінічні біохімічні дослідження слід проводити після
функціональних спостережень на 4-му тижні дослідження.
Можливе проведення необов'язкового аналізу сечі протягом
останнього тижня дослідження з використанням збору сечі,
розпланованого за часом; досліджується зовнішній вигляд, об'єм,
осмотична концентрація або питома вага, pH, протеїни, клітини
глюкози і крові/клітин крові.
Окрім того, слід розглянути можливість проведення досліджень
для виявлення маркерів сироватки загального ушкодження тканини.
Якщо відомі властивості досліджуваної речовини можуть, або
передбачається, що вони можуть завдати шкоди метаболічним
показникам, включаючи показники кальцію, фосфату, основних
тригліцеридів, специфічних гормонів, метгемоглобіну та
холінестерази, потрібно виконати інші аналізи. Їх слід визначати
для певних класів речовин або від випадку до випадку.
У цілому потрібен гнучкий підхід, що залежить від
біологічного виду та/або впливу, що спостерігався чи очікується
від даної речовини.
Якщо історично встановлених вихідних даних недостатньо, слід
розглянути можливість визначення гематологічних і клінічних
біохімічних перемінних перед початком введення доз речовини.
1.4.3.5. Макроскопічні обстеження під час розтину
Всі тварини, що використовувались для дослідження, піддаються
повному і детальному макроскопічному обстеженню під час розтину,
що включає ретельний огляд зовнішньої поверхні тіла, всіх отворів,
черепної, грудної і черевної порожнин та їх вмісту. Печінку,
нирки, наднирники, яєчка, епідідіміс, тимус, селезінку, мозок та
серце усіх тварин слід позбавити від сполучної тканини, якщо це
потрібно, і виміряти їх вагу у вологому стані якомога скоріше
після препарування, щоб уникнути висихання.
Інші тканини слід зафіксувати за допомогою найбільш
придатного з точки зору як для типу тканини, так і для
передбаченого наступного гістопатологічного обстеження, фіксуючого
засобу: всі макроскопічні ушкодження, мозок (репрезентативні
області, включаючи головний мозок, мозочок та вароліїв міст),
спинний мозок, шлунок, товстий і тонкий кишечник (включаючи
Пейєрові бляшки), печінку, нирки, наднирники, селезінку, серце,
тимус, щитовидну залозу, трахею та легені (фіксуються вдуванням
фіксатора і подальшим зануренням), гонади, додаткові статеві
органи (наприклад, матка, простата), сечовий міхур, лімфатичні
вузли (бажано один лімфатичний вузол, що супроводжує маршрут
введення речовини та ще один, віддалений від маршруту введення
речовини для дослідження системних впливів), периферичні нерви
(сідничний або великий гомілковий) - переважно у безпосередній
близькості до м'язу та відділів кісткового мозку (або, в якості
альтернативи, свіжий вставлений в рамку аспірат кісткового мозку).
Клінічні та інші показники можуть виявити потребу в огляді
додаткових тканин. Також всі органи, які можуть розглядатися у
якості цільових органів, ґрунтуючись на відомих властивостях
досліджуваної речовини, слід зберігати.
1.4.3.6. Гістопатологічне обстеження
Повне гістопатологічне дослідження збережених органів і
тканин має здійснюватися на всіх тваринах в контрольній групі та у
групі, якій вводилася висока доза. Ці обстеження слід провести
також на тваринах з груп, де застосовуються інші дози, якщо у
групі, якій вводилася висока доза, спостерігалися зміни, викликані
введенням речовини.
Слід провести обстеження всіх макроскопічних ушкоджень.
При використанні супутньої групи необхідно здійснити
гістопатологічне дослідження тканин і органів, ідентифікованих як
такі, що проявляють вплив на піддослідні групи.
2. ДАНІ
Необхідно отримати індивідуальні дані. Також всі дані по
кожній піддослідній групі мають бути підсумовані у формі таблиці,
де зазначені кількість тварин на початку випробування, кількість
тварин, що померли під час випробування або були знищені з
гуманістичних міркувань, а також час смерті або знищення кожної
тварини, кількість тварин з ознаками токсичного впливу, опис
виявлених ознак токсичного впливу, включаючи час початку,
тривалість і силу токсичного впливу, кількість тварин з
ушкодженнями, типи ушкоджень і відсоток тварин з будь-якими типами
ушкоджень.
За можливості, цифрові результати слід оцінювати,
використовуючи відповідний і загальноприйнятий статистичний метод.
Статистичні методи обирають на етапі розробки плану дослідження.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ЩОДО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт щодо проведеного дослідження має, за можливості, містити
наступну інформацію:
Піддослідні тварини:
- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,
- кількість, вік і стать тварин
- походження, умови утримання, дієта, і т.д.
- вага кожної тварини на початку дослідження, а також через
кожен тиждень та наприкінці дослідження.
Умови випробування:
- обґрунтування вибору розчинника, окрім води,
- обґрунтування вибору рівня дозування,
- детальний склад досліджуваної речовини/розробки раціону
харчування, досягнута концентрація, стабільність і гомогенність
препарату,
- докладна інформація щодо застосування досліджуваної
речовини,
- перехід від концентрації досліджуваної речовини у
їжі/питній воді (в мільйонних долях) до поточної дози (мг/кг маси
тіла/день), у випадку застосування такого переходу,
- детальна інформація щодо якості їжі і води.
Результати:
- маса тіла/зміни маси тіла,
- споживання їжі і води, у випадку застосування,
- дані токсичної реакції з огляду на стать і рівень
дозування, включаючи ознаки токсичного впливу,
- природа, жорсткість умов і тривалість клінічних
спостережень (як щодо зворотних, так і щодо незворотних змін),
- оцінка сенсорної активності, сили захвату та моторної
активності,
- гематологічні дослідження з відповідним базисним
оцінюванням,
- клінічні біохімічні дослідження з відповідним базисним
оцінюванням,
- маса тіла при знищенні і дані про вагу органів,
- показники, виявлені під час розтину,
- детальний опис всіх гістопатологічних показників,
- дані щодо абсорбції, за наявністю,
- статистична обробка результатів, якщо вона є доцільною.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
Цей метод аналогічний методу, що застосовується у
ТІ ОЕСР 407.

B.8. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ
(ВВЕДЕНОЇ ЧЕРЕЗ ІНГАЛЯЦІЮ ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Корисно отримати попередню інформацію про розподіл розмірів
частинок, тиск пару, точку плавлення, точку кипіння, температуру
займання і вибуховість (якщо це є застосовним) речовини.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B (A).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (B).
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Кілька груп піддослідних тварин на певний період щоденно
піддають впливу досліджуваної речовини в градуйованих
концентраціях; одна концентрація використовується для однієї групи
протягом 28 днів. Якщо для створення відповідної концентрації
досліджуваної речовини в атмосфері, необхідне використання
контрольної групи розчинника, така група має бути використана.
Протягом періоду застосування за тваринами ведеться щоденне
спостереження для виявлення ознак токсичності. Проводиться розтин
тварин, які помирають під час дослідження, а по завершенні
дослідження проводиться їх розтин.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
Тварини утримуються в експериментальних умовах та у
відповідних умовах харчування протягом щонайменше п'яти днів перед
експериментом. Перед тестом тварин відбирають із застосуванням
випадкового відбору і розподіляють в необхідну кількість груп. За
необхідності, для створення відповідної концентрації речовини в
атмосфері до досліджуваної речовини може додаватися відповідний
розчинник. Якщо розчинник або інша домішка використовується для
полегшення дозування, вони повинні мати підтвердження того, що
вони не спричиняють токсичних впливів. Можливе використання
історично встановлених даних, якщо це є доцільним.
1.6.2. Умови проведення дослідження
1.6.2.1. Піддослідні тварини
Якщо немає протипоказань, перевага при виборі з біологічних
видів гризунів надається щуру. Слід залучити для випробувань
лабораторні лінії здорових молодих тварин, що зазвичай
використовуються.
На початку дослідження коливання ваги використовуваних тварин
не повинно становити +- 20% від відповідного середнього показника.
1.6.2.2. Кількість і стать
Щонайменше 10 тварин (п'ять самців і п'ять самок) слід
використовувати для кожної піддослідної групи. Тварини жіночої
статі мають бути не вагітними і такими, що ніколи не народжували.
Якщо заплановане проміжне знищення тварин, їх кількість потрібно
збільшити на кількість тварин, яких планується знищити до
завершення дослідження. На додаток, супутній групі з 10 тварин (по
5 тварин кожної статі) може вводитися доза найвищої концентрації
протягом 28 днів, а також проводяться спостереження щодо
зворотності, витривалості або відстроченої ймовірності токсичного
впливу впродовж 14 днів після введення речовини. Також
використовується супутня група з 10 контрольних тварин (по
5 тварин кожної статі).
1.6.2.3. Концентрація для впливу
Потрібно щонайменше три концентрації, з використанням
контролю або контролю розчинника (що відповідає концентрації
розчинника на найвищому рівні), якщо розчинник використовується.
За винятком введення досліджуваної речовини, за тваринами в
контрольній групі доглядають так само, як і за тваринами
піддослідної групи. Найвища концентрація має призводити до
токсичних впливів але не спричиняти смерть, принаймні масову.
Найнижча концентрація не повинна виявляти жодних ознак
токсичності. Якщо існують придатні до використання оцінки впливу
на людину, найнижча концентрація має перевищувати концентрацію,
використану в попередніх дослідженнях. В ідеалі, проміжна
концентрація має спричиняти мінімальні токсичні впливи, які
можливо спостерігати. Якщо використовується більш ніж одна
проміжна концентрація, концентрації мають розташовуватись на
відстані одна від одної для забезпечення градуювання токсичних
впливів. Для отримання значущих результатів у групах, де
застосовується речовина в низькій і проміжних концентраціях, а
також в контрольній групі, повинен бути низький відсоток
смертності.
1.6.2.4. Час впливу
Тривалість щоденного впливу має становити шість годин, проте,
для задоволення специфічних вимог може виникнути потреба в зміні
тривалості.
1.6.2.5. Обладнання
Дослідження на тваринах слід проводити за допомогою
інгаляційного обладнання, здатного забезпечувати динамічний потік
повітря протягом щонайменше як 12 обмінів повітря за годину для
підтримання відповідного вмісту кисню та рівномірно розподіленої
атмосфери впливу. При використанні камери її конструкція має
забезпечувати мінімальне скупчення піддослідних тварин і
максимальний вплив інгаляції досліджуваною речовиною. Загальне
правило для забезпечення стабільності атмосфери в камері означає,
що загальний "об'єм" піддослідних тварин не повинен перевищувати
5% об'єму камери для дослідження. Вплив за допомогою камери може
бути рото-носовим, тільки на голову або індивідуальним на все
тіло; перші два варіанти дозволяють мінімізувати поглинання через
інші шляхи.
1.6.2.6. Період спостереження
За піддослідними тваринами ведеться щоденне спостереження з
метою виявлення ознак токсичності під час всього періоду введення
речовини та часу відновлення. Час смерті та час, коли з'явились і
зникли ознаки токсичності, має фіксуватися.
1.6.3. Процедура
Тварин щоденно піддають впливу досліджуваної речовини, від
5 до 7 днів на тиждень протягом 28 днів. Тваринам у будь-якій
супутній групі, призначеним для подальшого спостереження, не слід
нічого вводити впродовж подальших 14 днів для визначення
витривалості чи відновлення після токсичних впливів. Температура,
за якої проводиться випробування, має підтримуватись на рівні
22 +- 3 град.C.
В ідеалі, відносна вологість має становити від 30 до 70%, але
в певних випадках (наприклад, випробування деяких аерозолів) це
може бути нездійсненним. Підтримання злегка від'ємного тиску
всередині камери (<= 5 мм води) запобігатиме витоку досліджуваної
речовини в навколишнє середовище. Тваринам не дають їжі і води під
час впливу.
Потрібно використовувати динамічну інгаляційну систему з
відповідною аналітичною системою контролю концентрації. Для
встановлення відповідної концентрації для впливу рекомендується
проведення контрольного випробування. Потік повітря слід
відрегулювати для забезпечення гомогенності умов у камері для
впливу. Система має забезпечувати досягнення стабільних умов
впливу якомога швидше.
Вимірювання або моніторинг слід проводити щодо:
(a) швидкості потоку повітря (постійно),
(b) поточної концентрації досліджуваної речовини, що
вимірюється в зоні дихання. Впродовж щоденного періоду впливу
концентрація не повинна коливатися у межах більш ніж +- 15% від
середнього показника. Проте, у випадку застосування деяких
аерозолів контрольного рівня неможливо досягти, тому може бути
прийнятий ширший діапазон. Впродовж усього періоду дослідження
повсякденна концентрація має підтримуватись на можливому
стабільному рівні. Для аерозолів слід проводити щонайменше один
аналіз розмірів частинок на тиждень для піддослідної групи.
(c) температури і вологості, за можливості постійно.
Під час подальшого впливу проводяться спостереження та їх
результати фіксуються систематично; для кожної тварини дані мають
записуватись окремо. Спостереження всіх тварин мають здійснюватися
щоденно, а ознаки токсичного впливу - фіксуватися, включаючи час
початку, ступінь та тривалість. Спостереження мають включати зміни
в шкірі, хутрі, очах, слизових оболонках, функціонуванні
дихальної, кровоносної вегетативної та центральної нервової
систем, соматомоторній активності та стереотипі поведінки.
Вимірювання ваги тварин слід проводити щотижня. Також
рекомендується щотижня вимірювати споживання їжі. Необхідно
здійснювати регулярне спостереження за тваринами з метою
запобігання втрати тварин через такі причини, як канібалізм,
автоліз тканин або неправильне розміщення. По закінченню періоду
дослідження робиться розтин всіх тварин з несупутніх груп, що
вижили. Помираючі тварини та тварини, що постійно страждають,
мають бути вилучені, як тільки про цей факт помітять, знищені
гуманним способом і піддані розтину.
Наступні дослідження проводяться наприкінці випробування для
всіх тварин, включаючи тих, що входять до складу контрольної
групи:
гематологія, включаючи принаймні гематокрит, концентрація
гемоглобіну, підрахунок еритроцитів, загальний і диференціальний
підрахунок лейкоцитів, підрахунок і вимірювання потенціалу
згортання;
клінічні дослідження біохімії крові, включаючи принаймні один
параметр функцій печінки та нирок: аланін-амінотрансфераза
сироватки (раніше відома як глютамінова піровиноградна
трансаміназа), аспартат-амінотрансфераза сироватки (раніше відома
як глютамінова щавелевооцтова трансаміназа), азот сечовини крові,
альбумін, креатинін крові, загальний білірубін і загальні
вимірювання протеїнів сироватки;
Інші аналізи, які можуть бути необхідними для адекватної
токсикологічної оцінки, включають аналіз показників кальцію,
фосфору, хлориду, соди, калію, аналіз глюкози натщесерце на вміст
жирів, гормонів, кислотно-лужний баланс, активність метгемоглобіну
та холінестерази.
За необхідності, з метою розширеного вивчення виявлених
токсичних впливів можуть проводитися додаткові клінічні біохімічні
дослідження.
1.6.3.1. Макроскопічні обстеження під час розтину
Всі тварини, що використовувались для дослідження, піддаються
повному макроскопічному обстеженню. Принаймні печінку, нирки,
наднирники, легені і яєчка слід зважити у вологому стані якомога
скоріше після препарування, щоб уникнути висихання. Органи і
тканини (дихальний тракт, печінку, нирки, селезінку, яєчка,
наднирники, серце і будь-які органи, в яких виявлено макроскопічні
ушкодження або зміни розміру) потрібно зберігати у відповідному
засобі для можливого гістопатологічного дослідження у майбутньому.
Легені слід витягти неушкодженими, зважити і закріпити за
допомогою відповідного фіксатора, щоб забезпечити збереження
легеневої структури.
1.6.3.2. Гістопатологічне обстеження
В контрольній групі (групах) і групі, якій вводилася доза
високої концентрації, слід провести гістопатологічне дослідження
збережених органів і тканин. Органи і тканини, в яких було
виявлено ушкодження, приписуються досліджуваній речовині при
найвищому рівні дозування, та такі органи слід обстежити в усіх
групах низького дозування. Для тварин будь-якої з супутніх груп
потрібно провести гістопатологічне дослідження, приділяючи
особливу увагу органам та тканинам, визначених як ті, що мають
ознаки впливу, в інших піддослідних групах.
2. ДАНІ
Дані мають бути підсумовані у формі таблиці, де зазначені
кількість тварин на початку проведення дослідження і кількість
тварин з будь-якими ушкодженнями для кожної піддослідної групи.
Всі виявлені результати слід оцінювати, використовуючи
відповідний статистичний метод. Можливе використання будь-якого
визнаного статистичного методу.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
За можливості, звіт про повинен проведення дослідження має
містити таку інформацію:
- біологічні види, лінії, походження, умови навколишнього
середовища, дієта, і т.д.
- умови досліду.
Опис апарату для введення, включаючи конструкцію, тип,
розміри, джерело повітря, систему подачі аерозолів, метод
кондиціонування повітря та метод утримання тварин у камері для
випробування дослідження за умови її використання. Обладнання для
вимірювання температури, вологості і, за необхідності,
стабільності концентрації аерозолю або розподілу розмірів частинок
також має бути описане.
Дані з піддавання впливу:
Вони мають бути представлені у формі таблиці з середніми
показниками і ступенем мінливості (наприклад, стандартне
відхилення) і за можливості мають включати:
(a) швидкість потоку повітря через інгаляційне обладнання;
(b) температуру і вологість повітря;
(c) номінальні концентрації (загальну кількість досліджуваної
речовини, що подається в інгаляційне обладнання, поділену на об'єм
повітря);
(d) природу розчинника, якщо він використовується;
(e) поточну концентрацію в досліджуваній зоні дихання;
(f) загальний серединний аеродинамічний діаметр (ЗСАД) і
відхилення від геометричного стандарту (ВГС);
- дані токсичної реакції в залежності від статі і
концентрації,
- час смерті під час дослідження або випадки, коли тварини
дожили до моменту знищення,
- опис токсичних або інших впливів, рівень відсутності
впливу,
- час спостереження будь-якої аномальної ознаки і подальший
перебіг її розвитку,
- дані про масу тіла і харчування,
- проведені гематологічні дослідження та їх результати,
- проведені біохімічні дослідження та їх результати,
- показники, виявлені під час розтину,
- докладний опис всіх гістопатологічних показників,
- статистична обробка результатів, якщо вона є доцільною,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (D).
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (E).

B.9. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ
(ВВЕДЕНОЇ ЧЕРЕЗ ШКІРУ ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B (A).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (B).
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Досліджувана речовина прикладається щоденно до шкіри
градуйованими дозами кільком групам піддослідних тварин, одна доза
для однієї групи протягом 28 днів. Протягом періоду прикладання за
тваринами ведеться щоденне спостереження для виявлення ознак
токсичності. Проводиться розтин тварин, які помирають під час
дослідження, а по завершенні дослідження проводиться розтин тих
тварин, що вижили.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
Тварини утримуються в експериментальних умовах і у
відповідних умовах харчування протягом щонайменше п'яти днів перед
проведенням дослідження. Перед тестом тварин відбирають методом
сліпого відбору і розподіляють в піддослідну і контрольну групи.
Незадовго до випробування хутро обстригається зі спинної частини
тулубу піддослідних тварин. Можливе застосування гоління, яке
потрібно здійснити приблизно за 24 години до проведення
дослідження. Повторне обстригання або гоління зазвичай слід
проводити приблизно з інтервалом у тиждень. При обстриганні або
голінні хутра необхідно подбати про те, щоб уникнути потертості
шкіри. Не меш ніж 10% поверхні тіла слід очистити для застосування
досліджуваної речовини. При вирішенні питання про зону очищення та
розміри покриття потрібно враховувати вагу тварини. При тестуванні
твердих речовин, які можуть подрібнюватися в порошок, якщо це є
доцільним, досліджувана речовина повинна бути достатньо зволожена
водою або, за необхідності, відповідним розчинником з метою
забезпечення тісного контакту зі шкірою. Рідкі досліджувані
речовини, зазвичай, застосовуються нерозбавленими.
Використовується схема щоденного застосування від 5 до 7 днів на
тиждень.
1.6.2. Умови проведення дослідження:
1.6.2.1. Піддослідні тварини
Можуть використовуватись дорослі щури, кролики або морські
свинки. Можливе використання інших біологічних видів, але їх
використання вимагає обґрунтування.
На початку дослідження коливання ваги використовуваних тварин
не повинно перевищувати +- 20% від відповідного середнього
показника.
1.6.2.2. Кількість і стать
Щонайменше 10 тварин (п'ять самців і п'ять самок) зі здоровою
шкірою слід використовувати для кожного рівня дозування. Тварини
жіночої статі мають бути не вагітними і такими, що ніколи не
народжували. Якщо заплановане проміжне знищення тварин, їх
кількість потрібно збільшити на кількість тварин, яких планується
знищити до завершення дослідження. Окрім того, супутній групі з
10 тварин (по 5 тварин кожної статі) може даватися доза високого
рівня протягом 28 днів, а також проводяться спостереження щодо
зворотності, витривалості або відстроченої ймовірності токсичного
впливу впродовж 14 днів після введення речовини. Також
використовується супутня група з 10 контрольних тварин (по
5 тварин кожної статі).
1.6.2.3. Рівень дозування
Потрібно щонайменше три рівня дозування з використанням
контролю або контролю розчинника, якщо розчинник використовується.
Період впливу має становити щонайменше шість годин на день.
Прикладання досліджуваної речовини слід здійснювати в один і той
самий час кожного дня і вивірити інтервали (тижневий або
двотижневий) для підтримання постійного рівня дозування в
залежності від ваги тварини. За винятком введення досліджуваної
речовини, за тваринами в контрольній групі доглядають так само, як
і за тваринами піддослідної групи. Якщо розчинник використовується
для полегшення дозування, контрольна група повинна отримувати таку
саму дозу, як і піддослідні групи, і отримувати таку саму
кількість, яку отримує група з найвищим рівнем дозування. Найвищий
рівень дозування повинен призводити до токсичних впливів, але не
спричиняти смерть, принаймні масову. Найнижчий рівень дозування не
повинен виявляти ніяких ознак токсичності. Якщо існують придатні
для використання оцінки впливу на людину, найнижчий рівень
дозування має перевищувати використаний в попередніх дослідженнях.
В ідеалі, середній рівень дозування має спричиняти мінімальні
токсичні впливи, які можливо спостерігати. Якщо використовується
більш ніж одна проміжна доза, рівні дозування повинні
розташовуватись на відстані один від одного для забезпечення
класифікації токсичних впливів. Для отримання значущих результатів
у групах, де застосовується речовина в низькій і проміжних
концентраціях, а також в контрольній групі, повинен бути низький
відсоток смертності.
Якщо застосування досліджуваної речовини спричиняє сильне
подразнення шкіри, концентрацію слід зменшити, результатом чого
буде зменшення або відсутність інших токсичних впливів при
високому рівні дозування. Більш того, якщо шкіру було сильно
пошкоджено, може виникнути необхідність у завершенні дослідження і
здійсненні нового дослідження з нижчими концентраціями.
1.6.2.4. Тестування на граничний вміст
Якщо попереднє дослідження на рівні дозування, який становить
1000 мг/кг, або на вищому рівні дозування щодо можливого впливу на
людину, якщо він є відомим, не виявило токсичних впливів,
необхідність в проведенні подальших досліджень може зникнути.
1.6.2.5. Період спостереження
За піддослідними тваринами ведеться щоденне спостереження з
метою виявлення ознак токсичності. Час смерті та час, коли
з'явились і зникли ознаки токсичності, має фіксуватися.
1.6.3. Процедура
Тварин потрібно доглядати окремо. Тварин щоденно піддають
впливу досліджуваної речовини, в ідеалі 7 днів на тиждень протягом
28 днів. Тваринам у будь-якій супутній групі, призначеним для
подальшого спостереження, не слід нічого вводити впродовж
подальших 14 днів для визначення витривалості чи відновлення після
токсичних впливів. Період впливу має становити щонайменше шість
годин на день.
Досліджувана речовина наноситься рівномірно на зону тіла, яка
складає приблизно 10% загальної поверхні тіла. При використанні
високотоксичних речовин площа покритої поверхні може зменшуватись,
але якомога більша площа має бути покрита якомога тоншим і більш
рівномірним шаром речовини.
Під час впливу досліджувана речовина прикріплюється до шкіри
за допомогою губчастої марлевої пов'язки та не подразнюючої
стрічки. Зона тестування повинна далі вкриватися відповідним чином
з метою утримання марлевої пов'язки і досліджуваної речовини та
запобігання можливості ковтання твариною досліджуваної речовини.
Для запобігання ковтання досліджуваної речовини можна
використовувати фіксатори, проте, повне обмеження рухливості
іммобілізація не рекомендується. В якості альтернативи можна
використовувати "захисний прилад на комір".
По закінченні періоду впливу залишок досліджуваної речовини
слід прибрати, де це можливо, використовуючи воду або інший
відповідний спосіб очищення шкіри.
Спостереження всіх тварин має здійснюватися щоденно, а ознаки
токсичного впливу - фіксуватися, включаючи час початку, ступінь та
тривалість. Спостереження мають включати зміни в шкірі, хутрі,
очах, слизових оболонках, а також у функціонуванні дихальної,
кровоносної, вегетативної та центральної нервової систем,
соматомоторній активності та стереотипі поведінки. Вимірювання
ваги тварин потрібно проводити щотижня. Також рекомендується
щотижня вимірювати споживання їжі. Необхідно здійснювати регулярне
спостереження за тваринами з метою запобігання втрати тварин через
такі причини, як канібалізм, автоліз тканин або неправильне
розміщення. По закінченні періоду дослідження робиться розтин всіх
тварин з несупутніх груп, що вижили. Помираючі тварини та тварини
що постійно страждають, мають бути вилучені, як тільки цей факт
помітять, знищені гуманним способом і піддані розтину.
Наступні дослідження проводяться наприкінці проведення
тестування всіх тварин, включаючи тих, що входять до складу
контрольної групи:
1) гематологія, включаючи принаймні гематокрит, концентрацію
гемоглобіну, підрахунок еритроцитів, загальний і диференціальний
підрахунок лейкоцитів, підрахунок і вимірювання потенціалу
згортання;
2) клінічні дослідження біохімії крові, включаючи принаймні
один параметр функцій печінки та нирок: аланін-амінотрансфераза
сироватки (раніше відома як глютамінова піровиноградна
трансаміназа), аспартат-амінотрансфераза сироватки (раніше відома
як глютамінова щавелевооцтова трансаміназа), азот сечовини,
альбумін, креатинін крові, загальний білірубін і загальні протеїни
сироватки;
Інші аналізи, що можуть бути необхідними для адекватної
токсикологічної оцінки, включають аналіз показників кальцію,
фосфору, хлориду, соди, калію, аналіз глюкози натщесерце на вміст
жирів, гормонів, кислотно-лужний баланс, активність метгемоглобіну
та холінестерази.
За необхідності, можуть проводитися додаткові клінічні
біохімічні дослідження для розширеного вивчення виявлених впливів.
1.6.4. Макроскопічні обстеження під час розтину
Всіх тварин, що використовувались для дослідження, піддають
повному макроскопічному обстеженню під час розтину. Принаймні
печінку, нирки, наднирники, яєчка слід зважити у вологому стані
якомога скоріше після препарування, щоб уникнути висихання. Органи
і тканини, тобто неушкоджена шкіра і шкіра після впливу
досліджуваної речовини, печінка, нирки, селезінка, яєчка,
наднирники, серце і цільові органи (будь-які органи, в яких
виявлено макроскопічні ушкодження або зміни розміру) потрібно
зберігати у відповідному засобі для можливого гістопатологічного
дослідження у майбутньому.
1.6.5. Гістопатологічне обстеження
В контрольній групі і групі, якій вводилася висока доза,
потрібно провести гістопатологічне дослідження збережених органів
і тканин. Органи і тканини, в яких було виявлено ушкодження,
приписуються досліджуваній речовині при найвищому рівні дозування,
та такі органи слід обстежити в усіх групах низького дозування.
Для тварин будь-якої з супутніх груп потрібно провести
гістопатологічне дослідження, приділяючи особливу увагу органам та
тканинам, визначених як ті, що мають ознаки впливу, в інших
піддослідних групах.
2. ДАНІ
Дані повинні бути підсумовані у формі таблиці, де зазначені
кількість тварин на початку дослідження і кількість тварин з
будь-якими ушкодженнями для кожної піддослідної групи.
Всі виявлені результати слід оцінювати, використовуючи
відповідний статистичний метод. Можливе використання будь-якого
визнаного статистичного методу.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
За можливості, звіт про проведення дослідження має містити
наступну інформацію:
- дані про тварину (біологічні види, лінії, походження, умови
навколишнього середовища, дієта, і т.д.)
- умови дослідження (включаючи тип пов'язки: оклюзивна або
неоклюзивна),
- рівні дозування (включаючи розчинник, якщо він
використовується) та концентрації,
- рівень відсутності впливу, де можливо,
- дані токсичної реакції в залежності від статі і дозування,
- час смерті під час дослідження або випадки, якщо тварини
дожили до знищення,
- токсичні або інші впливи,
- час спостереження будь-якої аномальної ознаки і подальший
перебіг її розвитку,
- дані про масу тіла і харчування,
- проведені гематологічні дослідження та їх результати,
- проведені біохімічні дослідження та їх результати,
- показники, виявлені під час розтину,
- докладний опис всіх гістопатологічних показників,
- статистична обробка результатів, де вона є можливою,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (D).
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (E).

B.10. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VITRO
НА ХРОМОСОМНУ АБЕРАЦІЮ ССАВЦІВ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 473, Тест
In Vitro на Хромосомну Аберацію Ссавців (1997).
1.1. ВСТУП
Метою тесту in vitro на хромосомну аберацію є визначення
агентів, які спричиняють структурні хромосомні аберації у
культивованих клітинах ссавців (1)(2)(3). Структурні аберації
можуть бути двох типів: хромосомні або хроматидні. При
використанні більшості хімічних мутагенів спровоковані аберації
належать до хроматидного типу, але трапляються також аберації
хромосомного типу. Підвищення поліплоїдії може означати, що
хімічна речовина має потенціал для провокування кількісних
аберацій. Проте цей метод було розроблено не для вимірювання
кількісних аберацій і, зазвичай, він не використовується з цією
метою. Хромосомні мутації та пов'язані з ними явища є причиною
багатьох генетичних хвороб людини, і є суттєві докази того, що
хромосомні мутації та пов'язані з ними явища, що спричиняють зміни
в онкогенах і генах-супрессорах пухлин соматичних клітин, беруть
участь у викликанні раку у людини і піддослідних тварин.
Тест in vitro на хромосомну аберацію може залучати культури
усталених ліній клітин, штамів клітин або первинних клітинних
культур. Клітини для використання відбираються, спираючись на
здатність культури до зростання, стабільність каріотипу, кількість
хромосом, різноманітність хромосом та частоту спонтанних
хромосомних аберацій.
Для проведення дослідження in vitro, зазвичай вимагається
використання екзогенного джерела метаболічної активації. Ця
система метаболічної активації не може повністю імітувати умов
функціонування організму ссавців in vivo. Необхідно подбати про
те, щоб уникнути умов, які призводять до позитивних результатів,
які не відображають спадкової мутагенності і можуть походити від
змін pH, осмотичного тиску або високого рівня цитотоксичності
(4)(5).
Це дослідження застосовується для виявлення можливих
мутагенів і канцерогенів у ссавців. Багато сполук, що дають
позитивний результат у цьому дослідженні, є канцерогенами ссавців;
проте, немає абсолютного взаємозв'язку між цим дослідженням та
канцерогенністю. Взаємозв'язок залежить від класу хімічних
речовин, і збільшується кількість даних, які доводять існування
канцерогенів, що не виявляються за допомогою цього дослідження,
оскільки є припущення, що вони діють через інші механізми, а не
пошкоджують ДНК напряму.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Аберація хроматидного типу: структурне хромосомне
пошкодження, що виявляється в утворенні розривів окремих хроматид
або в утворенні розривів і об'єднанні хроматид.
Аберація хромосомного типу: структурне хромосомне
пошкодження, що виявляється в утворенні розривів або в утворенні
розривів і об'єднанні обох хроматид на ідентичній ділянці.
Ендоредуплікація: процес, у якому після S-періоду реплікації
ядро ДНК починає не процес мітозу, а новий S-період. Результатом є
хромосоми з 4, 8, 16... хроматидами.
Геп: ахроматичне ушкодження, менше за ширину хроматиди, та з
мінімальним порушенням орієнтації хроматид).
Мітотичний індекс: співвідношення клітин у метафазі, поділене
на загальну кількість клітин, що спостерігаються в популяції
клітин; показник ступеню розростання цієї популяції.
Кількісна аберація: зміна кількості хромосом від
характеристик нормальної кількості у використаних клітинах.
Поліплоїдія: помноження галоїдної кількості хромосом (n) на
відміну від диплоїдної кількості (тобто, 3n, 4n і т.д.).
Структурна аберація: зміна в структурі хромосом, що
визначається при мікроскопічному дослідженні стадії метафази
поділу клітини, яка спостерігається у вигляді делецій і
фрагментів, внутрішнього або взаємного обміну.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Клітинні культури піддають впливу досліджуваної речовини як
за участю, так і без участі метаболічної активації. Через
визначені інтервали після піддавання впливу досліджуваної речовини
клітинних культур, їх піддають дії речовин, що спричиняють
блокування метафази (наприклад, колцемід(R) або колхіцин),
збирають, зафарбовують, і метафазні клітини аналізують за
допомогою мікроскопу з метою виявлення присутності хромосомних
аберацій.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Клітини
Дозволяється використання різноманітних ліній клітин, штамів
клітин або первинних клітинних культур, включаючи людські клітини
(наприклад, фібробласти китайського хом'яка, лімфоцити
периферичної крові людини або іншого ссавця).
1.4.1.2. Середовище і умови для культур
Для підтримання культур слід використовувати відповідне
середовище та умови вирощування (ємності для культур, концентрацію
CO , температуру і вологость). Усталені лінії клітин і штами
2 необхідно регулярно перевіряти на стабільність модальної кількості
хромосом і відсутність зараження мікоплазмою; при виявленні
зараження, їх не слід використовувати. Потрібно знати тривалість
клітинного циклу для даних клітин і умови для них.
1.4.1.3. Підготовка культур
Усталені лінії клітин і штами: клітини розводяться з вихідної
культури, висіваються в культуральне середовище за такої
щільності, щоб клітини не злилися до часу збирання, і вирощуються
при температурі 37 град.C.
Лімфоцити: цільна кров піддається впливу антикоагулянту
(наприклад, гепарину) або відокремлені лімфоцити, отримані від
здорових об'єктів, додаються в культуральне середовище, що містить
міоген (наприклад, фітогемагглутинін) і вирощуються при
температурі 37 град.C.
1.4.1.4. Метаболічна активація
Клітини мають піддаватись впливу досліджуваної речовини як в
присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за
її відсутності. Найчастіше використовується система доповненої
коферментами пост-мітохондріальної фракції (S9), приготованої з
печінок гризунів, оброблених ензимами, включаючи такі агенти, як:
Арохлор-1254 (6)(7)(8)(9), або суміш фенобарбіталу та
в-нафтофлавону (10)(11)(12).
Пост-мітохондріальна фракція, зазвичай, використовується в
концентраціях в діапазоні від 1-10% в об'ємному співвідношенні в
кінцевому піддослідному середовищі. Стан системи метаболічної
активації може залежати від класу хімічних речовин, що
випробовується. В деяких випадках може бути доцільним використання
більш ніж однієї концентрації пост-мітохондріальної фракції.
Кількість подій, включаючи створення ліній клітин, що
виявляють специфічні аміноацил-тРНК-синтетази, за допомогою генної
інженерії, може надати потенціал для ендогенної активації. Вибір
ліній клітин для використання має бути науково виправданим
(наприклад, релевантністю цитохрому P450 ізоензиму для метаболізму
досліджуваної речовини).
1.4.1.5. Досліджувана речовина/Підготовка
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути за
допомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщо
це є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовини
можна додавати безпосередньо до досліджуваних систем та/або
розбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі препарати
досліджуваної речовини, якщо тільки дані щодо стабільності не
виявляють придатності до зберігання.
1.4.2. Умови тестування:
1.4.2.1. Розчинник/середовище
Не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовища
з досліджуваною речовиною, вони також повинні бути придатними для
виживання клітин і сумісними з діяльністю S9. Якщо
використовується не добре відомий розчинник/середовище, їх
включення має підтверджуватись даними, що доводять їхню
сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати
спочатку водний розчинник/середовище. При випробуванні речовин,
нестабільних при взаємодії з водою, використовувані органічні
розчинники не мають містити води. Воду можна усунути шляхом
додавання молекулярного сита.
1.4.2.2. Концентрації для впливу
При визначенні найвищої концентрації слід розглянути такі
критерії, як цитотоксичність, розчинність у досліджуваних системах
та зміни pH або осмотичного тиску.
Цитотоксичність слід визначати з та без метаболічної
активації в ході основного експерименту, використовуючи
відповідний показник цілісності та росту клітин, такий, як ступінь
щільності, реальна кількість клітин або мітотичний індекс.
Можливо, буде корисним визначення цитотоксичності та розчинності в
ході підготовчого експерименту. Потрібно використати щонайменше
три концентрації, придатні до аналізування. У випадку
цитотоксичності три концентрації мають покривати діапазон від
максимальної до незначної токсичності або її відсутності; це
зазвичай означає, що рівні концентрації мають бути відділені
більше, ніж фактором між 2 та Кк 10. У момент збору найвища
концентрація має суттєво зменшитись, що стосується ступеню
щільності, кількості клітин або мітотичного індексу (всі більш ніж
50%). Мітотичний індекс є непрямим показником
цитотоксичних/цитостатичних впливів і залежить від часу, що
пройшов після введення речовини. Проте, мітотичний індекс
застосовується для суспензійних культур, для яких інші вимірювання
токсичності можуть бути обтяжливими та непрактичними. Інформація
про кінетику клітинного циклу, така як середній час генерації
(СЧГ), може використовуватись в якості додаткової інформації.
Проте, СЧГ є загальним значенням, яке не завжди відображає
існування уповільнених субпопуляцій, і навіть найменше збільшення
середнього часу генерації може бути пов'язане з дуже значною
затримкою в часі оптимального виходу аберацій.
Для відносно не цитотоксичних речовин максимальна
концентрація для тестування має становити 5 мю л/мл, 5 мг/мл або
0,01 Моль, яка є найнижчою.
Для відносно нерозчинних речовин, які не є токсичними при
концентраціях, нижчих, ніж концентрація нерозчинності, найвища
використовувана доза має відповідати концентрації вище межі
розчинності у кінцевому культуральному середовищі наприкінці
періоду введення речовини. В деяких випадках, (наприклад, коли
токсичність проявляється тільки при вищій концентрації, ніж
найнижча концентрація нерозчинності) рекомендується проведення
тестування більш ніж на одній концентрації з видимим прискоренням.
Може бути корисною оцінка розчинності на початку і в кінці
тестування, тому що розчинність може змінюватися протягом періоду
впливу в досліджуваній системі завдяки присутності клітин, S9,
сироватки, і т.д. Нерозчинність можна визначити неозброєним оком.
Осад не повинен змінювати результати оцінювання.
1.4.2.3. Позитивні та негативні контрольні групи
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (розчинник
або середовище), як з метаболічною активацією, так і без неї,
мають входити до складу кожного експерименту. При використанні
метаболічної активації хімічна речовина, що використовується для
позитивної контрольної групи, має бути такою, що вимагає активації
для мутагенної реакції.
Для позитивної контрольної групи залучається відомий
кластоген з рівнем впливу, що передбачає відтворюване зростання по
відношенню до вихідних даних, яке можна виявити; це зростання
демонструє чутливість досліджуваної системи.
Концентрації для позитивної контрольної групи потрібно
обирати таким чином, щоб впливи чітко проявлялися, проте, щоб
ідентичність кодованих мікроскопічних препаратів не відразу
виявлялася пристроєм для зчитування. До речовин позитивної
контрольної групи належать:
------------------------------------------------------------------ | Умови метаболічної | Речовина |Номер РСХ|Номер ЄРІКХР| | активації | | | | |--------------------+--------------------+---------+------------| |Відсутність |Метилметансульфонат | 66-27-3 | 200-625-0 | |екзогенної |--------------------+---------+------------| |метаболічної |Етилметансульфонат | 62-50-0 | 200-536-7 | |активації |--------------------+---------+------------| | |Етилннитрозосечовина|759-73-9 | 212-072-2 | | |--------------------+---------+------------| | |Мітоміцин C | 50-07-7 | 200-008-6 | | |--------------------+---------+------------| | |4-нітроквінолін-N- | 56-57-5 | 200-281-1 | | |оксид | | | |--------------------+--------------------+---------+------------| |Присутність |Бензо(альфа)пірен | 50-32-8 | 200-028-5 | |екзогенної |--------------------+---------+------------| |метаболічної |Циклофосфамід | 50-18-0 | 200-028-5 | |активації |Циклофосфаміду |6055-19-2| | | |моногідрат | | | ------------------------------------------------------------------
Можна використати інші відповідні речовини позитивної
контрольної групи. Застосування хімічної речовини, що
використовується для позитивної контрольної групи з огляду на
клас, може розглядатись за наявності.
Негативна контрольна група, що складається окремо з
розчинника або середовища у досліджуваному середовищі, до якого
вводяться ті самі речовини, що й досліджуваним культурам, має бути
включена до періоду збору. Окрім того, контрольні групи, що не
піддавалися впливу досліджуваної речовини, теж повинні
використовуватись, якщо немає історично встановлених даних з
контролю, що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів
обраного розчинника.
1.4.3. Процедура
1.4.3.1. Введення досліджуваної речовини
Клітини, що розростаються, піддають дії досліджуваної
речовини як в присутності системи метаболічної активації, так і за
її відсутності. Обробка лімфоцитів має починатися приблизно через
72 години після мітогенної стимуляції.
1.4.3.2. Подвійні культури, зазвичай, мають використовуватися
у будь-якій концентрації, вони рекомендовані для негативних
контрольних культур/контрольних культур розчинника. Якщо між
подвійними культурами може спостерігатися мінімальна генетична
мінливість (13)(14), відповідно до історично встановлених даних
вона може бути прийнятною до використання стосовно одиночних
культур у будь-якій концентрації.
Газоподібні та летючі речовини випробовуються за допомогою
відповідних методів, таких як запечатані ємності для культур
(15)(16).
1.4.3.3. Час збору культур
При першому експерименті клітини мають піддаватись впливу
досліджуваної речовини як з метаболічною активацією, так і без
неї, від 3 до 6 годин і братись на зразок через проміжок часу,
еквівалентний приблизно 1,5 тривалості нормального клітинного
циклу після початку обробки (12). Якщо цей протокол дає негативні
результати як з активацією, так і без неї, слід провести
додатковий експеримент без активації з постійною дією речовини до
того, як культури візьмуть на зразок через проміжок часу,
еквівалентний приблизно 1,5 тривалості нормального клітинного
циклу. Певні хімічні речовини можуть з більшою готовністю
виявлятися за час обробки/взяття на зразок більший, ніж 1,5
тривалості циклу. Негативні результати з метаболічною активацією
необхідно підтверджувати в окремих випадках. У випадках, коли
підтвердження негативних результатів не вважається необхідним,
потрібно навести обґрунтування.
1.4.3.4. Підготовка хромосом
Клітинні культури піддають дії колцеміду(R) або колхіцину,
зазвичай, за час від однієї до трьох годин до збору. Кожну
клітинну культуру збирають і обробляють окремо для підготовки
хромосом. Підготовка хромосом включає в себе гіпотонічну обробку
клітин, фіксацію та зафарбовування.
1.4.3.5. Аналіз
Всі мікроскопічні препарати, включаючи препарати позитивної
та негативної контрольних груп, повинні отримати незалежний код
перед мікроскопічним аналізом. Оскільки процедури фіксації часто
призводять до розриву метафазних клітин із втратою хромосом,
оцінені клітини мають таким чином містити кількість центромерів,
рівну модальному числу +- 2 для всіх типів клітин. Щонайменше
200 метафаз, що добре розрослися, мають оцінюватися щодо
концентрації і контролю, рівномірно розподілених серед подвійних
культур, якщо вони застосовуються. Їх кількість можна зменшити,
якщо спостерігається велика кількість аберацій.
Хоча метою тесту є виявлення структурних хромосомних
аберацій, важливо фіксувати випадки поліплоїдії та
ендоредуплікації, якщо вони мають місце.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Експериментальною одиницею є клітина, тому потрібно оцінювати
кількість клітин зі структурними хромосомними абераціями. Різні
типи структурних хромосомних аберацій потрібно заносити в список
разом з їх кількістю і частотою для експериментальних і
контрольних культур. Гепи фіксуються окремо і про них
повідомляють, проте, зазвичай не включають в загальну частоту
аберацій.
Паралельні критерії цитотоксичності для всіх піддослідних
експериментальних і негативних контрольних культур в основних
експериментах з аберації також мають фіксуватися.
Потрібні індивідуальні дані. Також всі дані мають бути
підсумовані у формі таблиці.
Немає вимог до перевірки чіткої позитивної реакції. Сумнівні
результати повинні перевірятися за допомогою подальших досліджень,
переважно з використанням модифікації експериментальних умов.
Потреба у підтвердженні негативних результатів обговорювалася в
пункті 1.4.3.3. Модифікація параметрів дослідження з метою
розширення діапазону оцінюваних умов буде розглядатися в подальших
експериментах. Параметри дослідження, що можуть бути модифіковані,
включають в себе просторовий розподіл концентрації та умови
метаболічної активації.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату,
такі як збільшення, пов'язане з концентрацією, або відтворюване
збільшення кількості клітин з хромосомними абераціями. Перш за все
необхідно враховувати біологічну релевантність результатів.
Можливе використання статистичних методів в якості допоміжних при
оцінюванні результатів дослідження (3)(13). Статистична значимість
не має бути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію.
Зростання кількості поліплоїдних клітин може означати, що
досліджувана речовина має потенціал для пригнічення мітотичних
процесів та провокування кількісних хромосомних аберацій.
Зростання кількості клітин з ендоредуплікованими хромосомами може
означати, що досліджувана речовина має потенціал для пригнічення
розвитку клітинного циклу (17)(18).
Досліджувана речовина, результати якої не відповідають
вищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цій системі.
Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні або
негативні результати, в поодиноких випадках сукупність даних
виключає можливість визначеного судження про активність
досліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівними
або проблематичними, не зважаючи на кількість повторень
експерименту.
Позитивні результати тесту in vitro на хромосомну аберацію
означають, що досліджувана речовина викликає структурні хромосомні
аберації у культивованих соматичних клітинах ссавців. Негативні
результати означають, що в умовах дослідження досліджувана
речовина не викликає структурних хромосомних аберацій у
культивованих соматичних клітинах ссавців.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
Звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору розчинника.
- розчинність та стабільність досліджуваної речовини в
розчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Клітини:
- тип і джерело клітин,
- характеристики каріотипу та придатність використаного типу
клітин,
- можливу відсутність мікоплазми,
- інформація щодо тривалості клітинного циклу,
- стать донорів крові, цільна кров або відокремлені
лімфоцити, використаний міоген,
- можливу кількість пасажів,
- метод збереження культури клітин, у випадку застосування,
- модальну кількість хромосом.
Умови проведення тесту:
- ідентичність речовини, що спричиняє блокування метафази, її
концентрація та тривалість піддавання клітини впливу,
- обґрунтування для вибору концентрацій і кількості культур,
включаючи, наприклад, дані про цитотоксичність та обмеження щодо
розчинності, у випадку застосування,
- склад середовища, можлива концентрація CO ,
2
- концентрація досліджуваної речовини,
- об'єм середовища і доданої досліджуваної речовини,
- температура вирощування,
- час вирощування,
- тривалість дії речовини,
- можлива щільність клітин при висіванні,
- тип і склад системи метаболічної активації, включаючи
прийнятності,
- позитивні та негативні контрольні групи,
- методи підготовки мікроскопічних препаратів,
- критерії для оцінки аберацій,
- проаналізована кількість метафаз,
- методи вимірювання токсичності,
- критерії віднесення дослідження до позитивного,
негативного, або сумнівного розряду.
Результати:
- ознаки токсичності, наприклад, ступінь щільності, дані про
клітинний цикл, кількість клітин, мітотичний індекс,
- ознаки преципітації,
- дані про pH та осмотичний тиск досліджуваного середовища,
якщо визначені,
- визначення аберацій, включаючи гепи,
- кількість клітин з хромосомними абераціями і типи
хромосомних аберацій, наведені окремо для кожної досліджуваної і
контрольної культури,
- зміни в плоїдності, якщо вони помітні,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичний аналіз, якщо він має місце,
- паралельні дані позитивних та негативних контрольних груп
(розчинник або середовище),
- історично встановлені дані позитивних та негативних
контрольних груп (розчинник або середовище), з діапазонами,
середніми величинами та стандартними відхиленнями.
Обговорення результатів.
Висновки
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Evans, H.J., (1976) Cytological Methods for Detecting
Chemical Mutagens. В: Chemical mutagens, Principles and Methods
for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press,
New York and London, p. 1-29.
(2) Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T., (1985). TheIn
VitroChromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL)
Fibroblast Cells in Culture. В: Progress in Mutation Research,
Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers,
Amsterdam-New York-Oxford, p. 427-432.
(3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S.,
Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk,
S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and
Zeiger, E., (1978). Chromosome aberration and sister chromatic
exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108
chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), p. 1-175.
(4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate,
M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity
under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group
9. Mutation Res, 257, p. 147-204.
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K.,
(1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian
Cells. Mutation Res., 268, p. 297-305.
(6) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975). Methods
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the
Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res.,
31, p. 347-364.
(7) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for
the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.
(8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers,
M. and de Vogel, N., (1976) Cytogenetic Effects of
Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in
Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid
Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN)
in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation
Res., 37, p. 83-90.
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr., (1979)
Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix
In Vitro. Mutation Res., 66, p. 277-290.
(10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse,
D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992). Report of
UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to
Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays.
Mutagenesis, 7, p. 175-177.
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T.,
(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an
Inducer of Metabolic Activation Systems. В: de Serres, F.J.,
Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic
Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland,
p. 85-88.
(12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett,
J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T., (1994)
Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal
Aberrations. Mutation Res., 312, p. 241-261.
(13) Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett,
G., Chanter, D.O. and Phillips, B., (1989) Analysis of Data from
In Vitro Cytogenetic Assays. В: Statistical Evaluation of
Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University
Press, Cambridge, p. 141-154.
(14) Soper, K.A. and Galloway, S.M., (1994) Replicate Flasks
are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO
Cells. Mutation Res., 312, p. 139-149.
(15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982)
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile
Liquids. В: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds).
Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91-103.
(16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L.,
(1983) Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the
CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5,
p. 795-801.
(17) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese
hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation
Res., 119, p. 403-413.
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983)
Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells.
Cancer Res., 43, p. 1362-1364.

B.11. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VIVO НА ХРОМОСОМНУ
АБЕРАЦІЮ КІСТКОВОГО МОЗКУ ССАВЦІВ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 475, Тест на
Хромосомну Аберацію Кісткового Мозку Ссавців (1997).
1.1. ВСТУП
Тест на Хромосомну Аберацію Кісткового Мозоку Ссавців
використовується для виявлення структурних хромосомних аберацій,
викликаних досліджуваною речовиною у клітинах кісткового мозку
тварин, зазвичай гризунів (1)(2)(3)(4). Структурні хромосомні
аберації можуть бути двох типів: хромосомні або хроматидні.
Підвищення поліплоїдії може означати, що хімічна речовина має
потенціал для провокування численних аберацій. При використанні
більшості хімічних мутагенів спровоковані аберації належать до
хроматидного типу, але трапляються також аберації хромосомного
типу. Хромосомні мутації та пов'язані з ними явища є причиною
багатьох генетичних хвороб людини і є суттєві докази того, що
хромосомні мутації та пов'язані з ними явища, що спричиняють зміни
в онкогенах і генах-суппрессорах, беруть участь у провокуванні
раку у людини і в піддослідних системах.
Зазвичай для проведення цього тесту використовуються гризуни.
Кістковий мозок є цільовою тканиною в цьому випробуванні, так як
це високо васкуляризована тканина, що містить популяцію клітин зі
швидким циклом розвитку, які можна одразу відокремити та
використати. Інші біологічні види та цільові тканини не є
предметом даного методу.
Цей тест на хромосомну аберацію є особливо доцільним для
оцінки мутагенної загрози, оскільки він дає змогу розглянути
фактори метаболізму in vivo, фармакокінетику та процеси репарації
ДНК, хоча вони можуть змінюватися в залежності від біологічного
виду і тканини. Тестування in vivo також корисне для подальших
досліджень мутагенного впливу, визначеного за допомогою тестування
in vitro.
Якщо є докази того, що досліджувана речовина або реактивні
метаболіти не досягнуть цільової тканини, проведення цього
тестування не є доцільним.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Аберація хроматидного типу: структурне хромосомне
пошкодження, що виявляється в утворенні розривів окремих хроматид
або в утворенні розривів і об'єднанні хроматид.
Аберація хромосомного типу: структурне хромосомне
пошкодження, що виявляється в утворенні розривів або в утворенні
розривів і об'єднанні обох хроматид на ідентичній ділянці.
Ендоредуплікація: процес, у якому після S-періоду реплікації
ядро ДНК починає не процес мітозу, а новий S-період. Результатом є
хромосоми з 4, 8, 16... хроматидами.
Геп: ахроматичне ушкодження, менше за ширину хроматиди, та з
мінімальним порушенням орієнтації хроматид).
Мітотичний індекс: співвідношення клітин у метафазі, поділене
на загальну кількість клітин, що спостерігаються в популяції
клітин; показник ступеню розростання цієї популяції.
Кількісна аберація: зміна кількості хромосом від
характеристик нормальної кількості у використаних клітинах.
Поліплоїдія: помноження галоїдної кількості хромосом (n) на
відміну від диплоїдної кількості (тобто, 3n, 4n і т.д.).
Структурна аберація: зміна в структурі хромосом, що
визначається при мікроскопічному дослідженні метафазної стадії
поділу клітини, яка спостерігається у вигляді делецій і
фрагментів, внутрішнього або взаємного обміну.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Тварин піддають впливу досліджуваної речовини, використовуючи
відповідний шлях введення, і знищують у зазначений час після
втручання. Перш ніж знищити, тварин піддають дії речовин, що
спричиняють блокування метафази (наприклад, колцеміду(R) або
колхіцину). Потім виготовляють хромосомні препарати з кісткового
мозку тварин і зафарбовують їх, і метафазні клітини аналізують на
предмет хромосомних аберацій.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Вибір біологічних видів тварин
Зазвичай використовують щурів, мишей та китайських хом'яків,
хоча можливе також використання інших придатних видів ссавців.
Слід залучити для випробувань лабораторні лінії здорових молодих
дорослих тварин, що зазвичай використовуються. На початку
дослідження коливання ваги тварин має бути мінімальним і не
перевищувати +- 20% від середньої ваги для кожної статі.
1.4.1.2. Умови утримання і годування
Застосовуються загальні умови викладені у Загальному вступі,
Частині B, проте, оптимальним показником вологості є 50-60%.
1.4.1.3. Підготовка тварин
Здорових молодих дорослих тварин призначають в піддослідну
групу із застосуванням методу випадкового відбору. Клітки повинні
розташовуватись таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи їх
місця розташування. Тварини ідентифікуються окремо. Тварин
пристосовують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів.
1.4.1.4. Підготовка доз
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути за
допомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщо
це є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовини
можна ввести безпосередньо або розбавити перед введенням. Слід
застосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тільки
дані щодо стабільності не виявляють прийнятності до зберігання.
1.4.2. Умови тестування:
1.4.2.1. Розчинник/середовище:
Розчинник/середовище не має спричиняти токсичних впливів при
використаному рівні дозування, а також не має бути підозри на
хімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною.
Якщо використовується не добре відомий розчинник/середовище, їх
включення має підтверджуватись даними, що доводять їхню
сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати
спочатку водний розчинник/середовище.
1.4.2.2. Контрольні групи
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (з
використанням розчинника або середовища) мають входити до складу
групи кожної статі при випробуванні проведенні кожного тестування.
За винятком введення досліджуваної речовини, за тваринами в
контрольній групі доглядають так само, як і за тваринами
піддослідних груп.
Позитивні контрольні групи дають структурні аберації in vivo
при рівнях дозування, при яких очікувалося зростання по відношенню
до вихідних даних, яке можна виявити. Концентрації для позитивних
контрольних груп потрібно обирати таким чином, щоб впливи чітко
проявлялися, проте, щоб ідентичність кодованих мікроскопічних
препаратів не одразу виявлялася пристроєм для зчитування. Можливим
є варіант введення речовини позитивній контрольній групі іншим
шляхом, ніж вводилася досліджувана речовина, потім зразок береться
тільки один раз. За наявності, може розглядатись застосування
хімічної речовини, що використовується для позитивного контролю з
огляду на клас, якщо є доступним. До речовин для позитивного
контролю належать:
------------------------------------------------------------------ | Речовина | Номер РСХ | Номер ЄРІКХР | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Етилметансульфонат | 62-50-0 | 200-536-7 | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Етилннитрозосечовина | 759-73-9 | 212-072-2 | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Мітоміцин C | 50-07-7 | 200-008-6 | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Циклофосфамід | 50-18-0 | 200-015-4 | |Циклофосфаміду моногідрат | 6055-19-2 | | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Триетилнемеламін | 51-18-3 | 200-083-5 | ------------------------------------------------------------------
Негативні контрольні групи, яким вводиться тільки розчинник
або середовище, а в інших випадках вводяться ті ж речовини, що і
досліджуваним групам, мають включатися до кожного часу відбору
проб, якщо тільки не є прийнятною міжтваринна варіабельність, і
концентрація клітин з хромосомними абераціями доступна завдяки
історично встановленим даним з контролю. Якщо зразки у негативних
контрольних груп беруться один раз, найкращим часом є перший час
відбору проб. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалися
впливу досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщо
немає історично встановлених або опублікованих даних з контролю,
що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів обраного
розчинника.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Кількість і стать тварин
Кожна піддослідна і контрольна група має включати щонайменше
п'ять придатних для аналізу тварин кожної статі. Якщо на час
дослідження наявні дані інших досліджень на таких самих видах з
використанням такого самого шляху введення, що демонструють
відсутність суттєвої різниці у токсичності, пов'язаної зі статтю
тварин, буде достатньо проведення дослідження на одній статі. Якщо
вплив хімічних речовин на людину може залежати від статі, як
наприклад для деяких фармацевтичних засобів, дослідження слід
проводити на тваринах відповідної статі.
1.5.2. Графік введення
Досліджувані речовини переважно вводяться за один раз.
Досліджувані речовини можуть також вводитися розділеною дозою,
тобто робиться два введення у той самий день з перервою не більше
ніж у кілька годин для полегшення введення великого об'єму
речовини. Інший графік введення має бути науково обґрунтованим.
Зразки потрібно брати за два рази, окремо, після введення,
протягом одного дня. Для гризунів перший інтервал забору зразків
становить 1,5 тривалості нормального клітинного циклу (останній
зазвичай триває 12-18 годин) після введення речовини. Оскільки
час, необхідний для поглинання та метаболізму досліджуваної
речовини, а також її впливу на кінетику клітинного циклу, може
впливати на оптимальний час виявлення хромосомних аберацій,
рекомендується зібрати зразки пізніше, через 24 години після
першого збору зразків. Якщо використовується режим введення дози
розрахований на більш ніж один день, слід використовувати один час
забору зразка через 1,5 тривалості нормального клітинного циклу.
Перед знищенням тваринам вколюється інтраперитонально
відповідна доза речовини, що спричиняє блокування метафази
(наприклад, колцеміду(R) або колхіцину). Після того зразки з
тварин беруться через відповідні інтервали часу. Для мишей цей
інтервал складає приблизно від трьох до п'яти годин, для
китайських хом'яків - від чотирьох до п'яти годин. З кісткового
мозку збирають клітини і аналізують на предмет хромосомних
аберацій.
1.5.3. Рівень дозування
Якщо дальнометричне дослідження проводиться тому, що немає
наявних відповідних даних, воно має проводитися в тій самій
лабораторії з використанням тих самих біологічних видів, ліній,
статі та режиму введення, що використовувались в основному
дослідженні (5). Якщо проявляється токсичність, для першого часу
забору зразка використовується три рівні дозування. Ці рівні
дозування повинні покривати діапазон від максимальної до незначної
токсичності або її відсутності. При подальшому заборі зразків
потрібно використовувати лише найвищу дозу. Найвища доза
визначається як доза, за якої з'являються такі ознаки токсичності,
які при вищих рівнях дозування з дотриманням того самого режиму
можуть спричиняти смерть. Речовини зі специфічними видами
біологічної активності при низьких нетоксичних дозах (такі, як
гормони та мітогени) можуть бути винятками для критеріїв
встановлення дозування і мають оцінюватись в окремих випадках.
Найвища доза може також визначатися як доза, за якої з'являються
деякі показники токсичності у кістковому мозку (наприклад,
зменшення мітотичного індексу більш ніж на 50%).
1.5.4. Тестування на граничний вміст
Якщо випробування на одному рівні дозування, який становить
щонайменше 2000 мг/кг маси тіла з використанням введення за один
раз, або двох введень у той же день, не спричиняє видимих
токсичних впливів, і якщо генотоксичність не передбачається з
огляду на дані щодо структурно подібних речовин, то можливо, не
виникне необхідності в проведенні повного дослідження з
використанням трьох рівнів дозування. Для більш довготривалих
досліджень гранична доза становитиме 2000 мг/кг маса тіла/день для
введення речовини тривалістю до 14 днів, та 2000 мг/кг маса
тіла/день для введення речовини тривалістю довше 14 днів.
Очікуваний вплив на людину може визначати потребу в використанні
вищого рівня дозування під час тестування на граничний вміст.
1.5.5. Призначення доз
Досліджувана речовина, зазвичай, вводиться з їжею,
використовуючи зонд для штучного харчування або відповідну
інтубаційну трубку, або шляхом інтраперитонеальної ін'єкції. Інші
шляхи введення можуть використовуватися, якщо вони є
обґрунтованими. Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один
раз з їжею або ін'єкцією, залежить від розміру піддослідної
тварини. Об'єм не має перевищувати 2 мл/100 г маси тіла.
Використання об'ємів, більших за ці, має бути обґрунтованим. За
винятком подразнюючих чи роз'їдаючих речовин, які зазвичай
проявляють ускладнені впливи при більшій концентрації,
варіативність досліджуваного об'єму потрібно мінімізувати шляхом
пристосування концентрації до забезпечення постійного об'єму на
всіх рівнях дозування.
1.5.6. Підготовка хромосом
Відразу після знищення тварини береться кістковий мозок,
піддається впливу гіпотонічного розчину і фіксується. Потім
клітини розподіляються по поверхні мікроскопічних препаратів і
зафарбовуються.
1.5.7. Аналіз
Мітотичний індекс слід визначати як міру цититоксичності
щонайменше на 1000 клітин на тварину для всіх піддослідних тварин
(включаючи позитивні контрольні групи) та тварин з негативних
контрольних групп, яких не піддають впливу речовини.
Потрібно проаналізувати щонайменше 100 клітин кожної тварини.
Їх кількість можна зменшити, якщо спостерігається велика кількість
аберацій. Всі мікроскопічні препарати, включаючи препарати
позитивної та негативної контрольних груп, повинні отримати
незалежний код перед мікроскопічним аналізом. Оскільки процедури
приготування мікроскопічних препаратів часто призводять до розриву
метафаз із втратою хромосом, оцінені клітини мають таким чином
містити кількість центромерів, що дорівнює кількості 2n +- 2.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Індивідуальні дані тварин мають бути представлені у формі
таблиці. Експериментальною одиницею є тварина. Щодо кожної тварини
потрібно визначити кількість оцінених клітин, кількість аберацій
на одну клітину та кількість клітин зі структурними хромосомними
абераціями. Різні типи структурних хромосомних аберацій потрібно
заносити в список разом з їх кількістю і частотою для груп, які
піддають дії речовини, і контрольних груп. Гепи фіксуються окремо
і про них повідомляють, проте, зазвичай не включають до загальної
частоти аберацій. Якщо немає доказів підтвердження різниці реакції
в залежності від статі, для статистичного аналізу можливе
об'єднання даних щодо обох статей.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату,
оскільки збільшення кількості клітин з хромосомними абераціями,
пов'язане з дозуванням, або чітке збільшення кількості клітин з
абераціями у групі, якій вводилася єдина доза при одноразовому
заборі зразків. Перш за все необхідно враховувати біологічну
релевантність результатів. Можливе використання статистичних
методів в якості допоміжних при оцінюванні результатів тестування
(6). Статистична значимість не має бути єдиним фактором, що
визначає позитивну реакцію. Сумнівні результати мають перевірятися
за допомогою подальших досліджень, переважно з використанням
модифікації експериментальних умов.
Підвищення поліплоїдії може означати, що досліджувана
речовина має потенціал для провокування кількісних хромосомних
аберацій. Збільшення ендоредуплікацій може означати, що
досліджувана речовина має потенціал для пригнічення розвитку
клітинного циклу (7)(8).
Досліджувана речовина, результати якої не відповідають
вищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цьому
тестуванні.
Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні або
негативні результати, в поодиноких випадках сукупність даних
виключає можливість визначеного судження про активність
досліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівними
або дискутивними, не зважаючи на кількість проведених
експериментів.
Позитивні результати тесту in vivo на хромосомну аберацію
означають, що досліджувана речовина викликає хромосомні аберації у
кістковому мозку досліджуваних біологічних видів. Негативні
результати означають, що за досліджуваних умов досліджувана
речовина не викликає структурних хромосомних аберацій у кістковому
мозку досліджуваних біологічних видів.
Імовірність того, що досліджувана речовина або її метаболіти
досягнуть загального кровообігу або, особливо, цільової тканини
(наприклад, системна токсичність), підлягають обговоренню.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
Звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору розчинника.
- розчинність та стабільність досліджуваної речовини в
розчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Піддослідні тварини:
- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,
- кількість, вік і стать тварин
- походження, умови утримання, дієта, і т.д.
- вага кожної тварини на початку тестування, включаючи
діапазон ваги тіла, середні та стандартні відхилення для кожної
групи,
Умови тестування:
- позитивні та негативні контрольні групи (з використанням
розчинника або середовища),
- дані досліджень з виявлення діапазону, якщо вони
проводилися,
- обґрунтування вибору рівня дозування,
- докладна інформація щодо приготування досліджуваної
речовини,
- докладна інформація застосування досліджуваної речовини,
- обґрунтування вибору маршруту введення,
- методи перевірки того, що досліджувана речовина досягла
загального кровообігу або цільової тканини, у випадку
застосування,
- перехід від концентрації досліджуваної речовини у
їжі/питній воді (в мільйонних долях) до поточної дози (мг/кг маса
тіла/день), у випадку застосування,
- докладна інформація щодо якості їжі і води,
- детальний опис введення речовини та графіки забору зразків,
- методи вимірювання токсичності,
- ідентичність речовини, що спричиняє блокування метафази, її
концентрація та тривалість введення,
- методи підготовки мікроскопічних препаратів,
- критерії для оцінки аберацій,
- кількість проаналізованих клітин на одну тварину,
- критерії віднесення дослідження до позитивного,
негативного, або сумнівного розряду.
Результати:
- ознаки токсичності,
- мітотичний індекс,
- тип і кількість аберацій, наведені окремо для кожної
тварини,
- загальна кількість аберацій у групі з середніми показниками
та стандартними відхиленнями,
- загальна кількість клітин з абераціями у групі з середніми
показниками та стандартними відхиленнями,
- зміни в плоїдності, якщо вони помітні,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичний аналіз, якщо він має місце,
- дані паралельних негативних контрольних групп,
- історично встановлені дані негативних контрольних груп з
діапазонами, середніми показниками та стандартними відхиленнями,
- дані паралельних позитивних контрольних груп.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Adler, I.D., (1984) Cytogenetic Tests in Mammals. В:
Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S.Venitt and J.M.Parry
(Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275-306.
(2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H.,
McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells.
Mutation Res., 189, p. 157-165.
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G.,
Bootman, J. and Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenetic Assays.
В: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended
Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity
Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press,
Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
(4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D.,
Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B.,
Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou,
S. and Vannier, B., (1994) Report from the Working Group on the In
Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation
Res., 312, p. 305-312.
(5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A.,
Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G.,
Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of
British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society
Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays.
Mutagenesis, 7, p. 313-319.
(6) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E.,
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage,
J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays.
В: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing.
Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data.
D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge.
p. 184-232.
(7) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese
hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation
Res. 119, с. 403-413.
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983)
Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells.
Cancer Res., 43, p. 1362-1364.

B.12. МУТАГЕННІСТЬ - МІКРОЯДЕРНИЙ ТЕСТ IN VIVO
НА ЕРИТРОЦИТАХ ССАВЦІВ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЄСР 474,
Мікроядерний Тест на Еритроцитах Ссавців (1997).
1.1. ВСТУП
Мікроядерний тест in vivo на еритроцитах ссавців
використовується для виявлення пошкоджень хромосом веретена поділу
еритробластів, спричинених досліджуваною речовиною, шляхом аналізу
еритроцитів, взятих з кісткового мозку та/або клітин периферичної
кровоносної системи тварин, зазвичай гризунів.
Метою мікроядерного тесту є визначення речовин, що
спричиняють цитогенетичні пошкодження, результатом яких є
формування мікроядер, які містять уповільнені фрагменти хромосом
або цілі хромосоми.
Якщо еритробласт кісткового мозку розвивається в поліхромний
еритроцит, головне ядро виштовхується; будь-яке мікроядро, що
сформувалося, може залишитись в іншій без'ядерній цитоплазмі.
Візуалізація мікроядер в цих клітинах полегшена через відсутність
у них головного ядра. Збільшення концентрації мікроядерних
поліхромних еритроцитів у піддослідних тварин є показником
індукованих хромосомних пошкоджень.
Зазвичай для цього тесту використовується кістковий мозок
гризунів, оскільки поліхромні еритроцити виробляються у цій
тканині. Вимірювання мікроядерних незрілих (поліхромних)
еритроцитів у периферичній крові є однаково прийнятним для
будь-якого біологічного виду, в межах якого проявилася нездатність
селезінки видаляти мікроядерні еритроцити або адекватна чутливість
для виявлення речовин, що спричиняють кількісні хромосомні
аберації. Мікроядра можна вирізнити за допомогою кількох
критеріїв. Вони включають визначення присутності чи відсутності
кінетохорної або центромірної ДНК в мікроядрах. Концентрація
мікроядерних незрілих (поліхромних) еритроцитів є основною
кінцевою точкою. Кількість зрілих (нормохромних) еритроцитів в
периферичній крові, що містить мікроядра у заданій кількості
зрілих еритроцитів, може також використовуватись, як кінцева точка
аналізу, якщо тварин постійно піддають дії речовини впродовж
чотирьох тижнів або довше.
Цей мікроядерний тест in vivo на еритроцитах ссавців має
особливе значення для оцінки мутагенної загрози, оскільки він дає
змогу розглянути фактори метаболізму in vivo, фармакокінетику та
процеси репарації ДНК, хоча вони можуть змінюватися в залежності
від біологічного виду, тканини та генетичних кінцевих точок.
Аналіз in vivo також є корисним для подальших досліджень
мутагенного впливу, визначеного за допомогою системи in vitro.
Якщо є докази того, що досліджувана речовина або реактивні
метаболіти не досягнуть цільової тканини, застосування цього тесту
не є доцільним.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Центромер (Кінетохор): зона(и) хромосоми, яка(і) з'єднує
волокна мітотичного веретена під час поділу клітин, надаючи змогу
дочірнім хромосомам впорядковано рухатись до полюсів дочірніх
клітин.
Мікроядра: маленькі ядра, відділені від головних ядер клітин
і додаткові до них, що утворюються під час телофази мітозу
(мейозу) шляхом уповільнення фрагментів хромосом або цілих
хромосом.
Нормохромний еритроцит: зрілий еритроцит, якому не вистачає
рибосом; його можна відрізнити від незрілих, поліхромних
еритроцитів за плямами, що сприяють виділенню рибосом.
Поліхромний еритроцит: незрілий еритроцит, в проміжній стадії
розвитку, який все ще містить рибосоми і його можна відрізнити від
зрілих, нормохромних еритроцитів за плямами, що сприяють виділенню
рибосом.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Тварин піддають впливу досліджуваної речовини, використовуючи
відповідний шлях введення. Якщо використовується кістковий мозок,
тварин знищують у зазначений час після втручання, кістковий мозок
витягується, препарати готуються і зафарбовуються
(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Якщо використовується периферична кров,
кров беруть у зазначений час після піддавання дії речовини,
готують і зафарбовують мазкові препарати (4)(8)(9)(10). Для
досліджень з використанням периферичної крові між останнім
введенням речовини і збором клітин має пройти якомога менше часу.
Препарати аналізують з метою виявлення присутності мікроядер.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Вибір біологічних видів тварин
Якщо використовується кістковий мозок, дослідження
рекомендується проводити на мишах або щурах, хоча можливе також
використання інших придатних видів ссавців. Якщо використовується
периферична кров, дослідження рекомендується проводити на мишах.
Проте, можливе використання будь-яких придатних біологічних видів
ссавців, у яких проявилася нездатність селезінки видаляти
мікроядерні еритроцити або адекватна чутливість для виявлення
речовин, що спричиняють кількісні хромосомні аберації. Слід
залучити до тестування лабораторні лінії здорових молодих тварин,
що зазвичай використовуються. На початку дослідження коливання
ваги тварин має бути мінімальною і не перевищувати +- 20% від
середньої ваги для кожної статі.
1.4.1.2. Умови утримання і годування
Застосовуються загальні умови викладені у Загальному вступі,
Частині B, проте, оптимальним показником вологості є 50-60%.
1.4.1.3. Підготовка тварин
Здорових молодих дорослих тварин навмання призначають в
піддослідну групу. Тварини ідентифікуються окремо. Тварин
пристосовують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів.
Клітки повинні розташовуватись таким чином, щоб мінімізувати
можливі впливи їх місця розташування.
1.4.1.4. Підготовка доз
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути за
допомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщо
це є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовини
можна ввести безпосередньо або розбавити перед введенням. Слід
застосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тільки
дані щодо стабільності не виявляють прийнятності зберігання.
1.4.2. Умови тестування:
1.4.2.1. Розчинник/середовище:
Розчинник/середовище не мають спричиняти токсичних впливів
при використаному рівні дозування, а також не має бути підозри на
хімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною.
Якщо використовується не добре відомий розчинник/середовище, їх
включення повинне підтверджуватись посиланнями, що доводять їхню
сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати
спочатку водний розчинник/середовище.
1.4.2.2. Контрольні групи
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (з
використанням розчинника або середовища) мають входити до складу
групи кожної статі при кожному тестуванні. За вийнятком введення
досліджуваної речовини, за тваринами в контрольній групі
доглядають так само, як і за тваринами піддослідних груп.
Позитивні контрольні групи утворюють мікроядра in vivo при
рівнях дозування, при яких очікувалося зростання по відношенню до
вихідних даних, яке можна виявити. Концентрації для позитивних
контрольних груп слід обирати таким чином, щоб впливи чітко
проявлялися, проте, щоб ідентичність кодованих мікроскопічних
препаратів не одразу виявлялася пристроєм для зчитування. Можливим
є варіант введення речовини позитивній контрольній групі іншим
шляхом, ніж вводилася досліджувана речовина, потім зразок береться
тільки один раз. Окрім того, у випадку наявності може розглядатись
застосування хімічної речовини, що використовується для
позитивного контролю з огляду на клас. До речовин для позитивного
контролю належать:
------------------------------------------------------------------ | Речовина | Номер РСХ | Номер ЄРІКХР | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Етилметансульфонат | 62-50-0 | 200-536-7 | |-------------------------------+--------------+-----------------| |N-Етил-N-нитрозосечовина | 759-73-9 | 212-072-2 | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Мітоміцин C | 50-07-7 | 200-008-6 | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Циклофосфамід | 50-18-0 | 200-015-4 | |Циклофосфаміду моногідрат | 6055-19-2 | | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Триетилнемеламін | 51-18-3 | 200-083-5 | ------------------------------------------------------------------
Негативні контрольні групи, яким вводиться тільки розчинник
або середовище, а в інших випадках вводяться ті ж речовини, що і
досліджуваним групам, мають включатися до кожного часу відбору
проб, якщо тільки не є прийнятною міжтваринна варіативність, і
концентрація клітин з мікроядрами виявляється завдяки історично
встановленим даним з контролю. Якщо зразки у негативних
контрольних групп беруться один раз, найкращим часом є перший час
відбору проб. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалися
впливу досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщо
немає історично встановлених або опублікованих даних з контролю,
що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів обраного
розчинника.
Якщо використовується периферична кров, може також
розглядатися варіант забору зразків перед введенням речовини у
якості паралельного негативного контролю, але тільки для
короткотривалих досліджень периферичної крові (наприклад,
1-3 введення), коли результати будуть у межах очікуваного згідно з
історично встановленими даними з контролю діапазону.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Кількість і стать тварин
Кожна піддослідна і контрольна група мають включати
щонайменше п'ять придатних для аналізу тварин кожної статі (11).
Якщо на час дослідження наявні дані інших досліджень на таких
самих видах з використанням такого самого шляху введення, що
демонструють відсутність суттєвої різниці у токсичності,
пов'язаної зі статтю тварин, буде достатньо проведення тестування
на одній статі. Якщо вплив хімічних речовин на людину може
залежати від статі, як наприклад для деяких фармацевтичних
засобів, випробування слід проводити на тваринах відповідної
статі.
1.5.2. Графік введення
Немає рекомендацій щодо стандартного графіку введення
речовини (тобто, 1, 2, чи більше введень впродовж 24 годин).
Зразки з розширеного режиму введення дози приймаються до тих пір,
поки не проявиться позитивний вплив для цього дослідження або, для
негативного дослідження, до тих пір, поки не проявиться
токсичність або не буде застосована гранична доза, і дозування не
буде продовжене до часу збору зразків. Досліджувані речовини
можуть також вводитися розділеною дозою, тобто робиться два
введення у той самий день з перервою не більше ніж у кілька годин
для полегшення введення великого об'єму речовини.
Проведення тесту можливе з використанням двох способів:
а) тваринам одноразово вводиться досліджувана речовина.
Зразки кісткового мозку беруться щонайменше двічі, починаючи не
раніше ніж через 24 години, але й не пізніше ніж 48 годин, після
введення речовини з відповідними інтервалам між забором зразків.
Забір зразків раніше ніж через 24 години після введення речовини
має бути виправданим. Зразки периферичної крові беруться
щонайменше двічі, починаючи не раніше ніж через 36 годин, але й не
пізніше ніж 72 години, після введення речовини з відповідними
інтервалам між забором зразків. Якщо позитивний результат отримано
при одному заборі зразків, додатковий забір зразків непотрібен.
b) якщо речовина вводиться два чи більше разів на день
(наприклад, два чи більше введення за 24-годинний проміжок часу),
зразки слід брати один раз між 18 та 24 годинами після останнього
введення для кісткового мозку та один раз між 36 та 48 годинами
після останнього введення для периферичної крові (12); додатково
можливе використання іншого часу для забору зразків, якщо це
потрібно.
1.5.3. Рівень дозування
Якщо дальнометричне дослідження проводиться тому, що немає
придатних наявних відповідних даних, воно має проводитися в тій
самій лабораторії з використанням тих самих біологічних видів,
ліній, статі та режиму введення, що використовувались у основному
дослідженні (13). Якщо проявляється токсичність, для першого часу
забору зразка використовується три рівні дозування. Ці рівні
дозування повинні покривати діапазон від максимальної до незначної
токсичності або її відсутності. При подальшому заборі зразків слід
використовувати лише найвищу дозу. Найвища доза визначається як
доза, за якої з'являються такі ознаки токсичності, які при вищих
рівнях дозування з дотриманням того самого режиму можуть
спричиняти смерть. Речовини зі специфічними видами біологічної
активності при низьких нетоксичних дозах (такі, як гормони та
мітогени) можуть бути винятками з критеріїв встановлення дозування
і мають оцінюватись в окремих випадках. Найвища доза може також
визначатися як доза, за якої з'являються деякі показники
токсичності у кістковому мозку (наприклад, зменшення долі незрілих
еритроцитів у загальній кількості еритроцитів кісткового мозку чи
периферичної крові).
1.5.4. Тестування на граничний вміст
Якщо тестування на одному рівні дозування, який становить
щонайменше 2000 мг/кг маси тіла з використанням введення за один
раз, або двох введень у той же день, не спричиняє видимих
токсичних впливів, і якщо генотоксичність не передбачається з
огляду на дані щодо структурно подібних речовин, то можливо, не
виникне необхідності в проведенні розгорнутого дослідження з
використанням трьох рівнів дозування. Для більш довготривалих
досліджень гранична доза становитиме 2000 мг/кг маса тіла/день для
введення речовини тривалістю до 14 днів, та 2000 мг/кг маси
тіла/день для введення речовини тривалістю довше 14 днів.
Очікуваний вплив на людину може визначати потребу в використанні
вищого рівня дозування під час тестування на граничний вміст.
1.5.5. Призначення доз
Досліджувана речовина, зазвичай, вводиться з їжею,
використовуючи зонд для штучного харчування або відповідну
інтубаційну трубку, або шляхом інтраперитонеальної ін'єкції. Інші
шляхи введення можуть використовуватися, якщо вони є виправданими.
Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один раз з їжею або
ін'єкцією, залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм не має
перевищувати 2 мл/100 г маси тіла. Використання об'ємів, більших
за ці, має бути виправданим. За винятком подразнюючих чи
роз'їдаючих речовин, які зазвичай проявляють ускладнені впливи при
більшій концентрації, варіативність досліджуваного об'єму потрібно
мінімізувати шляхом пристосування концентрації до забезпечення
постійного об'єму на всіх рівнях дозування.
1.5.6. Препарат кісткового мозку/крові
Клітини кісткового мозку, зазвичай, беруть зі стегна або
великої берцової кістки одразу після знищення тварини. Як правило,
клітини відокремлюються зі стегна або великої берцової кістки,
препаруються і зафарбовуються згідно усталених методів.
Периферичну кров беруть з хвостової вени або іншої придатної
кровоносної судини. Клітини крові одразу зафарбовуються
суправітально (8)(9)(10), або готуються мазкові препарати, а потім
зафарбовуються. Використання специфічного зафарбовування ДНК
(наприклад, акридин оранжевий (14) або хехст 33258 плюс піролін-Y
(15)) може знищити деякі артефакти, пов'язані з використанням
неспецифічного зафарбовування ДНК. Ця перевага не виключає
використання стандартних видів зафарбовування (наприклад, за
допомогою барвника Гімза). Додаткові системи (наприклад, целюлозні
колонки для усування клітин з ядром (16)) також можуть
використовуватись за умови, якщо про ці системи відомо, що вони
адекватно використовуються для мікроядерного препарування в
лабораторії.
1.5.7. Аналіз
Частка незрілих еритроцитів у загальній кількості еритроцитів
(незрілих + зрілих) визначається для кожної тварини шляхом
підрахунку суми щонайменше 200 еритроцитів для кісткового мозку
або 1000 еритроцитів для периферичної крові (17). Всі
мікроскопічні препарати, включаючи препарати позитивної та
негативної контрольних груп, повинні отримати незалежний код перед
мікроскопічним аналізом. Щонайменше 200 незрілих еритроцитів на
одну тварину оцінюються з точки зору частки мікроядерних незрілих
еритроцитів. Додаткову інформацію можна отримати шляхом оцінки
зрілих еритроцитів на вміст мікроядер. При аналізі мікроскопічних
препаратів частка незрілих еритроцитів у загальній кількості
еритроцитів має становити не менше 20% від контрольного значення.
Якщо тварин постійно піддають дії речовини впродовж чотирьох
тижнів або довше, щонайменше 2000 зрілих еритроцитів на одну
тварину також можуть оцінюватися з точки зору долі мікроядер.
Системи для автоматизованого аналізу (аналізу зображення і
цитометрії потоку клітинних суспензій) є прийнятними
альтернативами ручного способу оцінювання, якщо він є відповідним
чином обґрунтованим та затвердженим.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Індивідуальні дані тварин мають бути представлені у формі
таблиці. Експериментальною одиницею є тварина. Кількість оцінених
незрілих еритроцитів, мікроядерних незрілих еритроцитів, і
кількість незрілих еритроцитів у загальній кількості еритроцитів
має вноситись до списку окремо для кожної піддослідної тварини.
Якщо тварин постійно піддають дії речовини впродовж чотирьох
тижнів або довше, дані щодо зрілих еритроцитів теж потрібно
наводити, якщо вони були зібрані. Частка незрілих еритроцитів у
загальній кількості еритроцитів та, у випадку застосування,
кількість мікроядерних еритроцитів наводиться для кожної тварини.
Якщо немає доказів на підтвердження різниці в реакції в залежності
від статі, для статистичного аналізу можливе об'єднання даних щодо
обох статей.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату,
такі як збільшення кількості клітин з мікроядерними клітинами,
пов'язане з дозуванням, або чітке збільшення кількості
мікроядерних клітин у групі, якій вводилася єдина доза при
одноразовому заборі зразків. Перш за все необхідно враховувати
біологічну релевантність результатів. Можливе використання
статистичних методів в якості допоміжних при оцінюванні
результатів дослідження (18)(19). Статистична значимість не має
бути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію. Сумнівні
результати мають перевірятися за допомогою подальших досліджень,
переважно з використанням модифікації експериментальних умов.
Досліджувана речовина, результати якої не відповідають
вищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цьому
тестуванні.
Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні або
негативні результати, в поодиноких випадках сукупність даних
виключає можливість визначеного судження про активність
досліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівними
або проблематичними, не зважаючи на кількість повторень
експерименту.
Позитивні результати мікроядерного тесту означають, що
речовина викликає утворення мікроядер, що є результатом
хромосомних ушкоджень або ушкоджень веретена поділу еритробластів
досліджуваних біологічних видів. Негативні результати означають,
що за досліджуваних умов досліджувана речовина не викликає
утворення мікроядер у незрілих еритроцитах досліджуваних
біологічних видів.
Ймовірність того, що досліджувана речовина або її метаболіти
досягнуть загального кровообігу або, особливо, цільової тканини
(наприклад, системна токсичність), підлягають обговоренню.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
Звіт про проведення тестування має містити наступну
інформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору розчинника.
- розчинність та стабільність досліджуваної речовини в
розчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Піддослідні тварини:
- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,
- кількість, вік і стать тварин,
- походження, умови утримання, дієта, і т.д.,
- вага кожної тварини на початку випробування, включаючи
діапазон ваги тіла, середні та стандартні відхилення для кожної
групи.
Умови тестування:
- дані позитивних та негативних контрольних груп (з
використанням розчинника або середовища),
- дані досліджень з виявлення діапазону, якщо вони
проводилися,
- обґрунтування вибору рівня дозування,
- докладна інформація щодо приготування досліджуваної
речовини,
- докладна інформація застосування досліджуваної речовини,
- обґрунтування вибору маршруту введення,
- методи перевірки того, що досліджувана речовина досягла
загального кровообігу або цільової тканини, у випадку
застосування,
- перехід від концентрації досліджуваної речовини у
їжі/питній воді (в мільйонних долях) до поточної дози (мг/кг маса
тіла/день), у випадку застосування,
- докладна інформація щодо якості їжі і води,
- детальний опис введення речовини та графіки забору зразків,
- методи підготовки мікроскопічних препаратів,
- методи вимірювання токсичності,
- критерії оцінювання мікроядерних незрілих еритроцитів,
- кількість проаналізованих клітин на одну тварину,
- критерії віднесення дослідження до позитивного,
негативного, або сумнівного розряду.
Результати:
- ознаки токсичності,
- доля незрілих еритроцитів у загальній кількості
еритроцитів,
- кількість мікроядерних незрілих еритроцитів, наведена
окремо для кожної тварини,
- середні +- стандартні відхилення мікроядерних незрілих
еритроцитів на групу,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичний аналіз та застосовані методи,
- паралельні та історично встановлені дані негативних
контрольних груп,
- дані паралельних позитивних контрольних груп.
- Обговорення результатів.
- Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Heddle, J.A., (1973) A Rapid In Vivo Test for Chromosomal
Damage, Mutation Res., 18, p. 187-190.
(2) Schmid, W., (1975) The Micronucleus Test, Mutation Res.,
31, p. 9-15.
(3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B.,
Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The
Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation
Res., 123, p. 61-118.
(4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone,
M.F. and Heddle, J.A., (1990) The In Vivo Micronucleus Assay in
Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S.
Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res.,
239, p. 29-80.
(5) MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M.,
(1983) Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for
Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. В
'Developments in Science and Practice of Toxicology', Ed.
A.W.Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam,
p. 555-558.
(6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H.,
Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D., (1987)
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian
Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res., 189, p. 103-112.
(7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby,
M.E., (1990) The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test:
Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits
Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14,
p. 513-522.
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and
Ishidate, M. Jr., (1990) The Micronucleus Assay with Mouse
Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated
Slides. Mutation Res., 245, p. 245-249.
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test,
(1992) Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes
by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the
5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res.,
p. 278, 83-98.
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test
(CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the
Environmental Mutagen Society of Japan), (1995) Protocol
recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus
test. Mutagenesis, 10, p. 153-159.
(11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D.,
Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti,
F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) In
Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312,
p. 293-304.
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S., (1995) An optimal,
generalised sampling time of 30 +- 6 h after double dosing in the
mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10,
p. 313-319.
(13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A.,
Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G.,
Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M., (1992) Report of
British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society
Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays.
Mutagenesis, 7, p. 313-319.
(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1983) An
Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the
Micronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241-247.
(15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G., (1983) A
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in
Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res.,
120, p. 269-275.
(16) Romagna, F. and Staniforth, C.D., (1989) The automated
bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, p. 91-104.
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G., (1995) Sample size for
the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte
ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347,
p. 97-99.
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A.,
Gatehouse, D.G. and Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenetics
Assay. В: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS
Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for
Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne,
Sydney, p. 115-141.
(19) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett,
G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and
Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic
Assays. В: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for
Mutagenicity Testing. Report Part III. Cambridge University Press,
Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184-232.

B.13/14. МУТАГЕННІСТЬ: ТЕСТ НА ЗВОРОТНУ МУТАЦІЮ
З ВИКОРИСТАННЯМ БАКТЕРІЙ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 471,
Бактеріальний Тест на Зворотну Мутацію (1997).
1.1. ВСТУП
Для бактеріального тесту на зворотну мутацію використовуються
штами тифозної сальмонели та кишкової палички, що потребують
амінокислоти для виявлення точкових мутацій, які спричиняють
заміну, додавання чи делецію однієї або кількох пар основ ДНК
(1)(2)(3). Принцип бактеріального тесту на зворотну мутацію
полягає у виявленні мутацій, що повертають до початкового стану
мутації, присутні в піддослідних штамах і відновлюють
функціональну властивість бактерії синтезувати необхідну
амінокислоту. Бактерії-ревертанти виявляють за їх здібністю до
зростання за відсутності амінокислоти, якої потребує материнський
піддослідний штам.
Точкові мутації є причиною багатьох генетичних хвороб людини
і є суттєві докази того, що точкові мутації в онкогенах і
генах-супрессорах соматичних клітин, пов'язані з утворенням пухлин
у людини і піддослідних тварин. Бактеріальний тест на зворотну
мутацію швидкий, недорогий, має відносно легкий механізм
проведення. Багато з піддослідних штамів мають декілька
характеристик, які роблять їх більш чутливими для визначення
мутацій, включаючи чутливі послідовності ДНК на ділянках реверсії,
збільшену проникність клітин для великих молекул та знищення
систем репарації ДНК або посилення вразливих для небезпечних
впливів процесів репарації ДНК. Специфічність піддослідних штамів
може надати деяку корисну інформацію щодо типів мутацій, що
викликані генотоксичними реагентами. Для бактеріального тесту на
зворотну мутацію наявна велика база даних результатів для широкого
діапазону структур, а також розроблені усталені методології для
тестування хімічних речовин з різними фізико-хімічними
властивостями, включаючи летючі складові.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Тест на зворотну мутацію як тифозної сальмонели , так і
кишкової палички виявляє мутацію в штамах, що потребують
амінокислоти (гістидин або триптофан відповідно) для розробки
штаму, незалежного від зовнішнього постачання амінокислоти.
Мутагени заміщення пари основ є реагентами, які спричиняють
базові зміни в ДНК. У тесті на зворотну мутацію ця зміна може
відбуватися як на ділянці вихідної мутації, так і на другій
ділянці бактеріального геному.
Мутаген, що викликає мутації зі зсувом рамки: реагенти, що
спричиняють додавання або делеції однієї чи більше пар основ у
ДНК, змінюючи, таким чином, рамку зчитування в РНК.
1.3. ПОЧАТКОВИЙ РОЗГЛЯД
Для бактеріального тесту на зворотну мутацію використовують
клітини, що відносяться до прокаріотів, які відрізняються від
клітин ссавців такими показниками, як поглинання, метаболізм,
хромосомна структура та процеси репарації ДНК. Дослідження, що
проводяться in vitro, зазвичай вимагають використання екзогенного
джерела метаболічної активації. Система метаболічної активації in
vitro не може повністю імітувати умов функціонування організму
ссавців in vivo. Таким чином, тест не надає повної інформації про
мутагенний і канцерогенний потенціал речовини при застосуванні до
ссавців.
Бактеріальний тест на зворотну мутацію, зазвичай,
застосовується в якості початкового обстеження на генотоксичну
активність та, зокрема, інтенсивності стимуляції точкових мутацій.
З обширної бази даних видно, що велика кількість хімічних речовин,
які є позитивними в цьому тесті, також проявляють мутагенну
активність в інших тестах. Є приклади мутагенних реагентів, що не
виявляються під час цього тесту, причини цих недоліків можна
віднести на рахунок специфічної природи визначеної кінцевої точки,
різниці в метаболічній активації, або різниці в біодоступності. З
іншого боку, фактори, що підвищують чутливісь бактеріального тесту
на зворотну мутацію, можуть призвести до переоцінки мутагенної
активності.
Бактеріальний тест на зворотну мутацію може не підходити для
оцінки певних класів хімічних речовин, наприклад, сполук з високим
бактерицидним ефектом (наприклад, певних антибіотиків) і тих, які
вважаються (або відомі) як такі, що особливим чином змінюють
систему реплікації клітин ссавців (наприклад, деякі топоізомеразні
інгібітори та певні нуклеозидні аналоги). В таких випадках тести
на мутацію ссавців можуть бути більш доцільними.
Хоча багато сполук, що дають позитивний результат у цьому
дослідженні, є канцерогенами ссавців, це співвідношення не є
абсолютним. Воно залежить від класу хімічних речовин, і є
канцерогени, що не виявляються за допомогою цього дослідження,
оскільки вони діють через інші, негенотоксичні, механізми, що
відсутні в бактеріальних клітинах.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Суспензії бактеріальних клітин піддають впливу досліджуваної
речовини як в присутності екзогенної системи метаболічної
активації, так і за її відсутності. У чашковому методі включення
ці суспензії змішуються з агаровою накладкою та одразу поміщаються
у чашку на мінімальний шар субстрату. У методі преінкубації
піддослідна суміш вирощується, а потім змішується з агаровою
накладкою перед тим, як помістити її у чашку на мінімальний шар
субстрату. Для обох технік після двох чи трьох днів вирощування
колонії-ревертанти підраховуються та порівнюються з кількістю
спонтанних колоній-ревертантів у чашках для контролю розчинника.
Для здійснення бактеріального тесту на зворотну мутацію
описано декілька процедур. Серед цих загально використовуваних
методів є чашковий метод включення (1)(2)(3)(4), метод
преінкубації (2)(3)(5)(6)(7)(8), метод флуктуації (9)(10) та метод
тимчасового призупинення (11). Також описані модифікації методів
для проведення тестування на газах і пароподібних речовинах (12).
Процедури, описані в межах методу, мають відношення перш за
все до чашкового включення та методів преінкубації. Обидва з них
придатні для проведення експериментів як з метаболічною
активацією, так і без неї. Деякі речовини можна визначити більш
ефективно, використовуючи метод преінкубації. Ці речовини належать
до класів хімічних речовин, які включають аліфатичні нітрозаміни
короткого ланцюга, двохвалентні метали, альдегіди, азобарвники та
діазосполуки, піролізідинові алкалоїди, сполуки та нітросполуки
алілу (3). Також визнано, що певні класи мутагенів не завжди
визначаються при використанні стандартних процедур, таких, як
чашковий метод включення або метод преінкубації. Це явище
розглядається як "вийнятки", і для визначення цих мутагенів
наполегливо рекомендується використання альтернативних процедур.
Можна ідентифікувати наступні "винятки" (разом з прикладами
процедур, які можуть використовуватись для їх визначення):
азобарвники та діазосполуки (3)(5)(6)(13), гази та летючі хімічні
речовини (12)(14)(15)(16) та глікозиди (17)(18). Відхилення від
стандартної процедури має бути науково виправданим.
1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.5.1. Підготовка
1.5.1.1. Бактерії
Свіжі культури бактерій вирощують до пізньої експоненційної
9 або ранньої стаціонарної фази росту (приблизно 10 клітин на мл).
Культури в пізній стаціонарній фазі використовувати непотрібно.
Необхідно, щоб культури, які використовуються для експерименту,
містили високий титр життєздатних бактерій. Титр може виявлятися
завдяки історично встановленим даним з контролю кривих росту або в
процесі кожного аналізу шляхом визначення кількості життєздатних
клітин під час чашкового експерименту.
Рекомендована температура вирощування - 37 град.C.
Потрібно використати щонайменше п'ять штамів бактерій. Вони
мають включати чотири штами тифозної сальмонели (TA 1535; TA 1537
або TA97a або TA97; TA98; та TA100), які продемонстрували свою
надійність і репродуктивну реактивність під час лабораторних
досліджень. Ці чотири штами тифозної сальмонели мають пари основ
генетичного коду в первинній реверсивній ділянці і, як відомо,
можуть не визначати певних окислюючих мутагенів, реагентів
перехресного зшивання та гідразинів. Такі речовини можна визначити
за допомогою штамів кишкової палички WP2 або тифозної сальмонели
TA102 (19), які мають пару основ кислотної обробки в первинній
реверсивній ділянці. Таким чином, рекомендованою комбінацією
штамів є:
- тифозна сальмонела TA1535, та
- тифозна сальмонела TA1537 або TA97 або TA97a, та
- тифозна сальмонела TA98, та
- тифозна сальмонела TA100, та
- кишкова паличка WP2 uvrA або WP2 uvrA (pKM101), або тифозна
сальмонела TA102.
Для виявлення мутагенів перехресного зшивання бажано включати
TA102 або додавати спеціальний штам репарації ДНК кишкової палички
(наприклад, кишкова паличка WP2 або кишкова паличка WP2 (pKM.101))
Для препарату вихідної культури, перевірки маркерів та
зберігання потрібно використовувати встановлені процедури. Потреба
в амінокислоті для росту повинна демонструватися для кожного
замороженого препарату вихідної культури (гістидин для штамів
тифозної сальмонели та триптофан для штамів кишкової палички).
Інші фенотипові властивості також мають бути перевірені; йдеться
про наступні характеристики: присутність чи відсутність R-плазмід
там, де це доцільно (тобто, резистентність штамів TA98, TA100 та
TA97a або TA97, WP2 uvrA та WP2 uvrA (pKM101) до ампіциліну та
резистентність штаму TA102 до ампіциліну+тетрацикліну);
присутність характерних мутацій (тобто, мутація rfa в тифозній
сальмонелі через чутливість до кристалвіолету та мутація uvrA
в кишковій паличці через чутливість до ультрафіолетового
світла) (2)(3). Штами також повинні призводити до спонтанних
чашкових підрахунків колоній-ревертантів в межах діапазонів
частоти, виявлених завдяки лабораторним історично встановленим
даним з контролю та переважно в діапазоні, зазначеному в
літературі.
1.5.1.2. Субстрат
Відповідний мінімальний агар (наприклад, що містить
мінімальний субстрат E Фогеля-Боннера та глюкозу) та верхній шар
агару, що містить гістидин та біотин або триптофан,
використовується для кількох поділів клітин.
1.5.1.3. Метаболічна активація
Бактерії повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як
в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за
її відсутності. Найчастіше використовується система доповненої
коферментами пост-мітохондріальної фракції (S9), приготованої з
печінок гризунів, оброблених ензимами, включаючи такі агенти, як
Арохлор-1254 (1)(2) або суміш фенобарбіталу та нафтофлавону
(18)(20)(21). Пост-мітохондріальна фракція, зазвичай,
використовується в концентраціях в діапазоні від 5 до 30% в
об'ємному співвідношенні в суміші S9. Вибір та стан системи
метаболічної активації можуть залежати від класу хімічних речовин,
що випробовуються. В деяких випадках може бути доцільним
використання більш ніж однієї концентрації пост-мітохондріальної
фракції. Для азобарвників та діазосполук найбільш придатним може
бути використання спрощеної системи метаболічної активації
(6)(13).
1.5.1.4. Досліджувана речовина/Підготовка
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути за
допомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщо
це є доцільним, перед обробкою бактерій. Рідкі досліджувані
речовини можна додавати безпосередньо до досліджуваних систем
та/або розбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі
препарати, якщо тільки дані щодо стабільності не виявляють
прийнятності зберігання.
Не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовища
з досліджуваною речовиною, вони також повинні бути придатними для
виживання бактерій і сумісними з діяльністю S9(22). Якщо
використовується не добре відомий розчинник/середовище, їх
включення має підтверджуватись даними, що доводять їхню
сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати
спочатку водний розчинник/середовище. При тестуванні речовин,
нестабільних при взаємодії з водою, використовувані органічні
розчинники не мають містити води.
1.5.2. Умови тестування:
1.5.2.1. Піддослідні штами (див. 1.5.1.1)
1.5.2.2. Концентрація для впливу
При визначенні найвищої кількості досліджуваної речовини, що
використовується, слід розглянути такі критерії, як
цитотоксичність та розчинність в останній піддослідній суміші.
Можливо, буде корисним визначення токсичності та
нерозчинності в ході підготовчого експерименту. Цитотоксичність
можна визначити за зменшенням кількості колоній-ревертантів,
очищенням чи зменшенням вихідного газону або ступенем виживання
культур, підданих дії речовини. Цитотоксичність речовини може
підвищуватися в присутності систем метаболічної активації.
Нерозчинність в останній суміші слід оцінювати як преципітацію за
наявних умов тестування; вона має визначатись неозброєним оком.
Рекомендована максимальна концентрація для тестування
розчинних не цитотоксичних речовин складає 5 мг/чашку або
5 мл/чашку. Для не цитотоксичних речовин, які не є розчинними при
концентрації 5 мг/чашку або 5 мл/чашку, один або більше
випробуваних варіантів концентрацій мають бути нерозчинними в
останній піддослідній суміші. Досліджувані речовини, що є
токсичними вже при концентрації нижчій, ніж 5 мг/чашку або
5 мл/чашку, мають досліджуватись до виявлення цитотоксичної
концентрації. Осад не повинен змінювати результати оцінювання.
Слід використовувати щонайменше п'ять різних придатних для
аналізу концентрацій досліджуваної речовини з приблизно половиною
занесених в журнал інтервалів (тобто, Кк 10) між точками
тестування для початкового експерименту. Менші інтервали є
доцільними, якщо реакцію на концентрацію виявлено. Можливість
тестування при концентрації вище 5 мг/чашку або 5 мл/чашку
розглядається, якщо речовини, що піддаються оцінці, містять
суттєву кількість потенційно мутагенних домішків.
1.5.2.3. Позитивний та негативний контроль
Паралельні штам-специфічні позитивні та негативні контрольні
групи (за розчинником або середовищем), як з метаболічною
активацією, так і без неї, мають входити до складу кожного
аналізу. Слід відбирати концентрації для позитивного контролю, що
демонструють ефективність при кожному аналізі.
Для аналізу за участю системи метаболічної активації слід
відбирати стандартні речовини для позитивного контролю на основі
типу штамів бактерій, що використовуються.
Наступні речовини є прикладами для застосування у відповідних
групах позитивного контролю для аналізу з використанням
метаболічної активації.
------------------------------------------------------------------ | Номери РСХ | Номери ЄРІКХР | Назви | |--------------+-----------------+-------------------------------| | 781-43-1 | 212-308-4 |9,10-диметил-антрацен | |--------------+-----------------+-------------------------------| | 57-97-6 | 200-359-5 |7,12-диметилбенз(альфа)антрацен| |--------------+-----------------+-------------------------------| | 50-32-8 | 200-028-5 |бензо(альфа)пірен | |--------------+-----------------+-------------------------------| | 613-13-8 | 210-330-9 |2-аміноантрацен | |--------------+-----------------+-------------------------------| | 50-18-0 | |циклофосфамід | |--------------+-----------------+-------------------------------| | 6055-19-2 | 200-015-4 |циклофосфаміду моногідрат | ------------------------------------------------------------------
Наступна речовина є відповідним засобом позитивного контролю
для спрощеного методу метаболічної активації:
------------------------------------------------------------------ | Номер РСХ | Номер ЄРІКХР | Назва | |--------------+-----------------+-------------------------------| | 573-58-0 | 209-358-4 |конго червоний | ------------------------------------------------------------------
2-аміноантрацен не слід використовувати в якості єдиного
індикатора ефективності суміші S9. Якщо використовується
2-аміноантрацен, кожну дозу S9 потрібно охарактеризувати за
допомогою мутагену, що вимагає метаболічної активації з
використанням мікросомальних ензимів, наприклад
бензо(альфа)пірену, диметилбензантрацену.
Наступні речовини є прикладами для застосування у відповідних
групах штам-специфічного позитивного контролю для аналізу з
використанням екзогенної системи метаболічної активації.
------------------------------------------------------------------ |Номери РСХ|Номери ЄРІКХР| Назви | Штам | |----------+-------------+-------------------+-------------------| |26628-22-8| 247-852-1 |натрієвий азид |TA 1535 та TA 100 | |----------+-------------+-------------------+-------------------| | 607-57-8 | 210-138-5 |2-нітрофлуорен |TA 98 | |----------+-------------+-------------------+-------------------| | 90-45-9 | 201-995-6 |9-аміноакридин |TA 1537, TA 97 та | | | | |TA 97a | |----------+-------------+-------------------+-------------------| |17070-45-0| 241-129-4 |ОКВ 191 |TA 1537, TA 97 та | | | | |TA 97a | |----------+-------------+-------------------+-------------------| | 80-15-9 | 201-254-7 |Гідропероксид |TA 102 | | | |кумолу | | |----------+-------------+-------------------+-------------------| | 50-07-7 | 200-008-6 |Мітоміцин C |WP2 uvrA та TA102 | |----------+-------------+-------------------+-------------------| | 70-25-7 | 200-730-1 |N-етил-N-нітро-N- |WP2, WP2 uvrA та | | | |нітрозогуанидин |WP2 uvrA (pKM101) | |----------+-------------+-------------------+-------------------| | 56-57-5 | 200-281-1 |4-нітроквинолін-1- |WP2, WP2 uvrA та | | | |оксид |WP2 uvrA (pKM101) | |----------+-------------+-------------------+-------------------| |3688-53-7 | |Фурилфурамід (AF2) |плазмідовмісні | | | | |штами | ------------------------------------------------------------------
Можна використати інші відповідні еталонні речовини для
позитивного контролю. Застосування хімічної речовини, що
використовується для позитивного контролю з огляду на клас може
розглядатись, якщо є доступним.
До складу мають входити негативні контрольні групи, що
складаються тільки з розчинника або тільки з середовища, без
досліджуваної речовини, яким вводяться ті ж речовини, що і
піддослідним групам. Окрім того, контрольні групи, що не
піддавалися впливу досліджуваної речовини, теж повинні
використовуватись, якщо немає історично встановлених даних з
контролю, що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів
обраного розчинника.
1.5.3. Процедура
Для чашкового методу включення (1)(2)(3)(4) без метаболічної
активації, зазвичай, 0,05 мл або 0,1 мл досліджуваних розчинів,
8
0,1 мл свіжої бактеріальної культури (що містить приблизно 10
життєздатних клітин) та 0,5 мл стерильного буферного розчину
змішуються з 2,0 мл верхнього шару агару. Для аналізу з
метаболічною активацією, зазвичай, 0,5 мл суміші для метаболічної
активації, що містить відповідну кількість пост-мітохондріальної
фракції (в діапазоні від 5 до 30% в об'ємному співвідношенні в
суміші для метаболічної активації) змішується з верхнім шаром
агару (2,0 мл) та бактеріями і розчином досліджуваної
речовини/досліджуваним розчином. Вміст кожної пробірки
перемішується та наливається на поверхню чашки з мінімальною
кількістю агару. Верхній шар агару дозволяється перевести в
твердий стан перед вирощуванням.
Для методу преінкубації (2)(3)(5)(6) досліджувана
речовина/досліджуваний розчин попередньо вирощується з
8 піддослідним штамом (що містить приблизно 10 життєздатних клітин)
стерильним буферним розчином системи метаболічної активації
(0,5 мл) зазвичай впродовж 20 хвилин або довше при 30-37 град.C до
того, як змішується з верхнім шаром агару та наливається на
поверхню чашки з мінімальною кількістю агару. Зазвичай, 0,05 мл
або 0,1 мл досліджуваної речовини/досліджуваного розчину, 0,1 мл
бактерій та 0,5 мл суміші S9 або стерильного буферного розчину
змішуються з 2,0 мл верхнього шару агару. Під час преінкубації
слід вентилювати пробірки за допомогою шейкеру.
Для адекватної оцінки варіації слід використовувати потрійний
метод вирощування на чашках Петрі для кожного рівня дозування.
Використання подвійного методу вирощування на чашках Петрі є
доцільним, якщо воно є науково виправданим. Випадкова втрата чашки
не обов'язково веде до визнання недійсними результатів аналізу.
Газоподібні та летючі речовини тестуються за допомогою
відповідних методів, таких як запечатані ємкості (12)(14)(15)(16).
1.5.4. Вирощування
Всі штами вирощуються на чашках при 37 град.C впродовж
48-72 годин. Після періоду вирощування підраховується кількість
колоній-ревертантів на чашку.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Дані мають бути представлені у вигляді кількості
колоній-ревертантів на чашку. Також потрібно навести кількість
колоній-ревертантів як у негативних (контроль за розчинником і
контроль без дії речовини, якщо використовується), так і у
позитивних чашках контролю. Для досліджуваної речовини та
позитивних і негативних контрольних груп (без дії речовини та/або
за розчинником) мають бути представлені індивідуальні чашкові
підрахунки, середня кількість колоній-ревертантів на чашку та
стандартні відхилення.
Немає вимог до перевірки чіткої позитивної реакції. Сумнівні
результати мають перевірятися за допомогою подальших досліджень,
переважно з використанням модифікації експериментальних умов.
Негативні результати потрібно підтверджувати в окремих випадках. У
випадках, коли підтвердження негативних результатів не вважається
необхідним, потрібно навести обґрунтування. Модифікація параметрів
дослідження з метою розширення діапазону оцінюваних умов буде
розглядатися в подальших експериментах. Параметри дослідження, що
можуть бути модифіковані, включають в себе просторовий розподіл
концентрації, метод піддавання впливу речовини (чашкове включення
або преінкубація рідини) та умови метаболічної активації.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату,
такі як збільшення відносно досліджуваного рівня, пов'язане з
концентрацією, та/або відтворюване збільшення при одній або
декількох варіантах концентрацій у кількості колоній-ревертантів
на чашку щонайменше в одному штамі як з системою метаболічної
активації, так і без неї (23). Перш за все необхідно враховувати
біологічну релевантність результатів. Можливе використання
статистичних методів в якості допоміжних при оцінюванні
результатів тестування (24). Проте, статистична значимість не має
бути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію.
Досліджувана речовина, результати тестування якої не
відповідають вищезазначеним критеріям, вважається немутагенною при
цьому тестуванні.
Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні або
негативні результати, в поодиноких випадках сукупність даних
виключає можливість однозначного судження про активність
досліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівними
або проблематичними, не зважаючи на кількість повторень
експерименту.
Позитивні результати бактеріального тесту на зворотну мутацію
означають, що речовина викликає точкові мутації шляхом заміни
основ або зсувів рамки в геномі як тифозної сальмонели, так і
кишкової палички. Негативні результати означають, що за
досліджуваних умов досліджувана речовина не є мутагенною для
досліджуваних біологічних видів.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
Звіт про проведення тестування містити наступну інформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору розчинника/середовища,
- розчинність та стабільність досліджуваної речовини в
розчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Штами:
- використовувані штами,
- кількість клітин на культуру,
- характеристики штамів.
Умови тестування:
- кількість досліджуваної речовини на чашку (мг/чашку або
мл/чашку) з обґрунтуванням вибору дозування і кількістю чашок на
одну концентрацію,
- використовуване середовище,
- тип і склад системи метаболічної активації, включаючи
прийнятності,
- процедури введення речовини.
Результати:
- ознаки токсичності,
- ознаки преципітації,
- індивідуальні чашкові підрахунки,
- середня кількість колоній-ревертантів на чашку та
стандартні відхилення,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичний аналіз, якщо він має місце,
- паралельні дані позитивних та негативних контрольних груп
(за розчинником або середовищем), з діапазонами, середніми
показниками та стандартними відхиленнями,
- історично встановлені дані позитивних та негативних
контрольних груп (за розчинником або середовищем), з діапазонами,
середніми показниками та стандартними відхиленнями.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E., (1975) Methods
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the
Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res.,
31, p. 347-364.
(2) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for
the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier,
L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger,
E., (1994) Recommendations for the Performance of Bacterial
Mutation Assays. Mutation Res., 312, p. 217-233.
(4) Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S.,
Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K.,
Prival, M., Rao, T.K. and Ray V., (1986) The Salmonella
typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S.
Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res.,
168, p. 69-240.
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T.,
Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y., (1975) Mutagenicity of
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1,
p. 91-96.
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T.,
Shirai, A. and Sawamura, M., (1980) Factors Modulating
Mutagenicity Microbial Tests. В: Short-term Test Systems for
Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C.,
Springer, Berlin-Heidelberg-New York. p. 273-285.
(7) Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender,
R.D. and Foster, R., (1980) Bacterial Mutation Assays. В: Basic
Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed.D.J. Kirkland,
Cambridge University Press, p. 13-61.
(8) Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L., (1987)
Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety,
8, p. 167-177.
(9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A., (1976) Use
of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens.
Mutation Res., 38, p. 33-42.
(10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W.
Bridges (1984) The Fluctuation Test in Bacteria. В: Handbook of
Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J.,
Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New
York-Oxford, p. 141-161.
(11) Thompson, E.D. and Melampy, P.J., (1981) An Examination
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains
of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3,
p. 453-465.
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima
(1994) Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous
Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307,
p. 335-344.
(13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D.
and Vaughn, V.L., (1984) Mutagenicity of Benzidine and
Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified
Salmonella Assay. Mutation Res., 136, p. 33-47.
(14) Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and
Mortelmans, K., (1992) Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results
from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19,
p. 2-141.
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G., (1977)
Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In
Progress in Genetic Toxicology, D.Scott, B.Bridges and F.Sobels
(Eds.) Elsevier, Amsterdam, p. 249-258.
(16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton,
L.D., (1987) Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity
of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay.
Environmental Mutagenesis, 9, p. 421-441.
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M.,
and Sugimura, T., (1979) Mutagenicity of the Naturally Occurring
Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in
Salmonella typhimurium. Cancer Res., 39, p. 3780-3782.
(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N.,
(1980) Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to
Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
p. 4961-4965.
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G.,
(1990) Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with
Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 285-291.
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T.,
(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an
Inducer or Metabolic Activation Systems. В: 'In vitro metabolic
Activation in Mutagenesis Testing' Eds. F.J. de Serres et al.
Elsevier, North Holland, p. 85-88.
(21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse,
D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992)
Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity
Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N., (1981)
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome
Test. Mutation Res., p. 88343-350.
(23) Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K.,
Nestmann, E. and Zeiger, E., (1987) Guide for the Salmonella
typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity.
Mutation Res. 189, с. 83-91.
(24) Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell,
I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J., (1989) Analysis of Data from
Microbial Colony Assays. В: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for
Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of
Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge University
Press, p. 28-65.

B.15. ДОСЛІДЖЕННЯ МУТАГЕННОСТІ ТА СКРИНІНГ
НА ГЕНЕТИЧНІ МУТАЦІЇ КАНЦЕРОГЕННОЇ ДІЇ - ПИВНІ ДРІЖДЖІ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Різноманітність гаплоїдних і диплоїдних штамів заквасок
пивних дріжджі можна використовувати для вимірювання виходу
генних мутацій, спричинених хімічними речовинами як з метаболічною
активацією, так і без неї.
Використовуються системи прямих мутацій у гаплоїдних штамах,
такі, як вимірювання мутацій від червоних мутантів, що потребують
аденіну, (ade-1, ade-2), до подвійних білих мутантів, що
потребують аденіну, і системи відбору, такі, як провокування
резистентності до канаваніну та циклогексиміду.
Найбільш усебічно оцінена система зворотної мутації включає в
себе використання гаплоїдного штаму XV 185-14C, який несе
нонсенс-мутації охри ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 та trp 5-48, які є
зворотними завдяки мутагенам заміни основ, що викликають
направлені мутації або мутації супресорів охри. XV 185-14C також
несе маркер his 1-7, міссенс-мутації здебільшого повертаються до
початкового стану шляхом мутацій у зворотний бік, та
маркер hom 3-10, що повертається до початкового стану завдяки
мутагену, що викликає мутації зі зсувом рамки.
В диплоїдних штамах пивних дріжджі в єдиним
загальновикористовуваним штамом є D , який є гомозиготним
7 за ilv 1-92.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ВИПРОБУВАНЬ
Підготовка
Розчини піддослідних хімічних речовин та контрольна речовина
повинні готуватися безпосередньо перед проведенням тестування з
використанням відповідного середовища. У випадку з органічними
сполуками, які не є розчинними у воді, потрібно використовувати не
більше 2% розчину органічних розчинників, таких як етанол, ацетон
чи диметилсульфоксид (ДМСО). Остаточна концентрація середовища не
повинна відчутно впливати на життєздатність клітин і
характеристики їх росту.
Метаболічна активація
Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічної
речовини як в присутності відповідної екзогенної системи
метаболічної активації, так і за її відсутності.
Найчастіше використовується система доповненої коферментами
пост-мітохондріальної фракції з печінок гризунів, попередньо
оброблених реагентами з включенням ензимів. Використання інших
біологічних видів, тканин, пост-мітохондріальних фракцій або
процедур також може бути доцільним для метаболічної активації.
Умови тестування:
Лінії-аналізатори
Гаплоїдний штам XV 185-14C та диплоїдний штам D найбільше
7 використовуються в дослідженнях генної мутації. Також може бути
більш доцільним використання інших штамів.
Середовище
Відповідне середовище для культур використовується для
визначення кількості одиниць, що вижили, і мутантів.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Позитивний контроль, контроль без піддавання впливу
досліджуваної речовини та контроль за розчинником мають
здійснюватись одночасно. Потрібно використовувати відповідні
речовини позитивного контролю для кожної окремої кінцевої точки
мутації.
Концентрація для впливу
Слід використовувати щонайменше п'ять концентрацій
досліджуваної речовини з адекватними проміжками між ними. Для
токсичних речовин найвища досліджувана концентрація не повинна
зменшувати показника одиниць, що вижили, менш ніж на 5-10%.
Відносно нерозчинні у воді речовини потрібно випробовувати до їх
межі розчинності з використанням відповідних процедур. Для
нетоксичних речовин, що вільно розчиняються у воді, найвища
концентрація визначається для кожного окремого випадку.
Умови інкубації
Чашки вирощують від чотирьох до семи днів при 28-30 град.C у
темряві.
Частота спонтанних мутацій
Субкультури повинні використовуватись зі спонтанною частотою
мутацій в межах прийнятого звичайного діапазону.
Кількість повторень
Для аналізу фототрофів, що утворилися в результаті генної
мутації, та життєздатності клітин потрібно використати щонайменше
три чашки для повторення для кожної концентрації. У випадку
проведення експериментів з використанням таких маркерів, як
hom 3-10 з низьким рівнем мутації, кількість використовуваних
чашок потрібно збільшити для отримання статистично відповідних
даних.
Процедура
Піддавання пивних дріжджів впливу речовини, зазвичай,
здійснюється згідно з процедурою випробування рідин, включаючи як
стаціонарні клітини, так і клітини у стадії росту. Початковий
експеримент потрібно здійснити на клітинах у стадії росту:
7 1-5 x 10 клітин/мл піддають впливу досліджуваної хімічної
речовини впродовж 18 годин при температурі 28-37 град.C,
збовтуючи; відповідна кількість елементів системи метаболічної
активації додається під час введення речовини, коли це доцільно.
Наприкінці періоду дії речовини клітини центрифугують, змивають та
висівають у відповідне культуральне середовище. Після інкубації
чашки оцінюють за ступенем виживання клітин та генних мутацій.
Якщо перший експеримент дає негативні результати, потрібно
провести другий експеримент з використанням клітин у стаціонарній
фазі. Якщо перший експеримент дає позитивні результати, їх слід
підтвердити шляхом проведення відповідного незалежного
експерименту.
2. ДАНІ
Дані мають бути представлені у формі таблиці з зазначенням
кількості підрахованих колоній, кількості мутантів, частоти
мутацій і виживання. Всі результати слід підтверджувати шляхом
незалежного експерименту. Дані слід оцінювати, використовуючи
відповідний статистичний метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
За можливості звіт про проведення тесту має містити наступну
інформацію:
- використовувані штами,
- умови проведення тесту: клітини у стаціонарній фазі або
клітини у стадії росту, склад середовища, температура і тривалість
інкубації, система метаболічної активації,
- умови піддавання дії речовини: рівень введення, процедура і
тривалість введення, температура введення, позитивний та
негативний контроль,
- кількість підрахованих колоній, кількість мутантів, частота
мутацій і виживання, співвідношення дози/реакції, у випадку
застосування, статистична оцінка даних,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.16. МІТОТИЧНА РЕКОМБІНАЦІЯ - ПИВНІ ДРІЖДЖІ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Мітотична рекомбінація в пивних дріжджах може визначатися між
генами (або, більш узагальнено, між геном і його центромером) та
всередині генів. Перший варіант називається мітотичним
кросинговером зі взаємним генеруванням продуктів, в той час, як
останній найчастіше не є взаємним і називається конверсією гена.
Кросинговер, зазвичай, аналізується за виробленням рецесивних
гомозиготних колоній або секторів, утворених в гетерозиготному
штамі, в той час, як конверсія гена аналізується за виробленням
фототрофічних ревертантів, утворених в ауксотрофному
гетероалельному штамі з двома різними дефектними алелями одного й
того ж гену. Найбільш часто використовуваними штамами для
визначення мітотичної конверсії гена є D4 (гетероалельний в
ade 2 та trp 5), D7 (гетероалельний у trp 5), BZ34 (гетероалельний
в arg 4) та JDl (гетероалельний в his 4 та trp 5). Мітотичний
кросинговер, що продукує червоні та рожеві гомозиготні сектори,
може оцінюватись через D або D (який також використовується для
5 7 вимірювання мітотичної конверсії гена та зворотної мутації в
ilv 1-92), обидва штами є гетероалельними для комплементарних
алелів ade 2.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ВИПРОБУВАНЬ
Підготовка
Розчини піддослідних хімічних речовин та контрольні або
базові сполуки повинні готуватися безпосередньо перед проведенням
тесту з використанням відповідного середовища. У випадку з
органічними сполуками, які є нерозчинними у воді, потрібно
використовувати не більше 2% розчину органічних розчинників, таких
як етанол, ацетон чи диметилсульфоксид (ДМСО). Остаточна
концентрація середовища не повинна відчутно впливати на
життєздатність клітин і характеристики їх росту.
Метаболічна активація
Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічної
речовини як в присутності відповідної екзогенної системи
метаболічної активації, так і за її відсутності. Найчастіше
використовується система доповненої коферментами
пост-мітохондріальної фракції з печінок гризунів, попередньо
оброблених реагентами з включенням ензимів. Використання інших
біологічних видів, тканин, пост-мітохондріальних фракцій або
процедур також може бути доцільним для метаболічної активації.
Умови тестування:
Штами-аналізатори
Штамами, що найчастіше використовуються, є диплоїди D , D ,
4 5
D та JD1. Може бути більш доцільним використання інших штамів.
7
Середовище
Відповідне середовище для культур використовується для
визначення кількості одиниць, що вижили, і частоти мітотичної
рекомбінації.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Позитивний контроль, контроль без піддавання впливу
досліджуваної речовини та контроль за розчинником мають
здійснюватись одночасно. Потрібно використовувати відповідні
речовини позитивного контролю для кожної окремої кінцевої точки
рекомбінації.
Концентрація для впливу
Потрібно використовувати щонайменше п'ять концентрацій
досліджуваної речовини з адекватними проміжками між ними. Серед
фактів, які потрібно взяти до уваги, слід зазначити
цитотоксичність та розчинність. Найнижча концентрація може не
впливати на життєздатність клітин. Для токсичних хімічних речовин
найвища досліджувана концентрація не повинна зменшувати показника
одиниць, що вижили, менш ніж на 5-10%. Відносно нерозчинні у воді
хімічні речовини потрібно випробовувати до їх межі розчинності з
використанням відповідних процедур. Для нетоксичних речовин, що
вільно розчиняються у воді, найвища концентрація визначається для
кожного окремого випадку.
Клітини можна піддавати впливу досліджуваної речовини як під
час стаціонарної фази, так і під час росту на періоди не більше
18 годин. Проте, якщо передбачається використання культур впродовж
більшого періоду часу, культури потрібно мікроскопічно дослідити
на предмет утворення спор, за умови присутності яких результати
тестування вважатимуться недійсними.
Умови інкубації
Чашки вирощують у темряві від чотирьох до семи днів при
28-30 град.C. Чашки, що використовуються для аналізу червоних та
рожевих гомозиготних секторів, утворених шляхом мітотичного
кросинговеру, потрібно тримати в холодильнику (при температурі
близько 4 град.C) впродовж 1-2 днів перед оцінюванням, що дає
змогу розвиватися відповідним пігментованим колоніям.
Частота спонтанних мітотичних рекомбінацій
Суб-культури повинні використовуватись зі спонтанною частотою
мутацій при мітотичних рекомбінаціях в межах прийнятого звичайного
діапазону.
Кількість повторень
Для аналізу фототрофів, що утворилися в результаті мітотичної
конверсії генів, та життєздатності потрібно використати щонайменше
три чашки для повторення для кожної концентрації. У випадку
проведення аналізу рецесивної гомозиготності, утвореної шляхом
мітотичного кросинговеру, кількість чашок слід збільшити для
забезпечення відповідної кількості колоній.
Процедури
Піддавання пивних дріжджів впливу речовини, зазвичай,
здійснюється згідно з процедурою випробування рідин, включаючи як
стаціонарні клітини, так і клітини у стадії росту. Початковий
експеримент потрібно здійснити на клітинах у стадії росту.
7 1-5 х 10 клітин/мл піддають впливу досліджуваної хімічної
речовини впродовж 18 годин при температурі 28-37 град.C,
збовтуючи; відповідна кількість елементів системи метаболічної
активації додається під час введення речовини, коли це доцільно.
Наприкінці періоду дії речовини клітини центрифугують,
змивають та висівають у відповідне культуральне середовище. Після
інкубації чашки оцінюють за ступенем виживання клітин та
мітотичної рекомбінації.
Якщо перший експеримент дає негативні результати, потрібно
провести другий експеримент з використанням клітин у стаціонарній
фазі. Якщо перший експеримент дає позитивні результати, їх слід
підтвердити шляхом незалежного експерименту.
2. ДАНІ
Дані мають бути представлені у формі таблиці з зазначенням
кількості підрахованих колоній, кількості рекомбінацій, колоній,
що вижили, та частоти рекомбінацій.
Результати потрібно підтверджувати шляхом незалежного
експерименту.
Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичний
метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
За можливості, звіт про проведення тесту має містити наступну
інформацію:
- використовувані штами,
- умови тестування: клітини у стаціонарній фазі або клітини у
стадії росту, склад середовища, температура і тривалість
інкубації, система метаболічної активації,
- умови піддавання дії речовини: концентрація введення,
процедура і тривалість введення, температура введення, позитивний
та негативний контроль,
- кількість підрахованих колоній, кількість рекомбінантів,
частота рекомбінацій і виживання, співвідношення дози/реакції, у
випадку застосування, статистична оцінка даних,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.17. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VITRO НА ГЕННУ
МУТАЦІЮ КЛІТИН ССАВЦІВ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 476, Тест
In Vitro на Генну Мутацію Клітин Ссавців (1997).
1.1. ВСТУП
Тест in vitro на генну мутацію клітин ссавців можна
використовувати для визначення генних мутацій, спричинених
хімічними речовинами. Придатними лініями клітин є клітини лімфоми
мишей L5178Y, штами клітин китайського хом'яка CHO, CHO-AS52 та
V79 та лімфобластоїдні клітини людини TK6 (1). В цих лініях клітин
найбільш часто використовувані генетичні кінцеві точки вимірюють
мутацію в тимідин-кіназі (ТК) та гіпоксантин-гуаніновій
фосфорибосил трансферази (ГГФТ) та трансгену ксантин-гуаніновій
фосфорибосил трансферази (КГФТ). Тести на мутації ТК, ГГФТ та КГФТ
визначають різні спектри генетичних процесів. Аутосомне
розташування ТК та КГФТ дає можливість виявлення генетичних
процесів (наприклад, великих делецій), що не виявляються у локусі
ГГФТ X-хромосом (2)(3)(4)(5)(6).
Для тесту in vitro на генну мутацію клітин ссавців можна
використовувати культури усталених ліній клітин або штамів клітин.
Клітини для використання відбираються, спираючись на здатність
культури до зростання та стабільність частоти спонтанних мутацій.
Дослідження, що проводяться in vitro, зазвичай вимагають
використання екзогенного джерела метаболічної активації. Ця
система метаболічної активації не може повністю імітувати умов
функціонування організму ссавців in vivo. Необхідно подбати про
те, щоб уникнути умов, які призводять до результатів, які не
відображають спадкової мутагенності. Результати, які не
відображають спадкової мутагенності, можуть походити від змін pH,
осмотичного тиску або високого рівня цитотоксичності (7).
Це дослідження використовується для обстеження на можливі
мутагени і канцерогени у ссавців. Багато сполук, що дають
позитивний результат у цьому дослідженні, є канцерогенами ссавців;
проте, немає абсолютного співвідношення між цим дослідженням та
канцерогенністю. Співвідношення залежить від класу хімічних
речовин, і збільшується кількість даних, які доводять існування
канцерогенів, що не виявляються за допомогою цього дослідження,
оскільки є припущення, що вони діють через інші, не генотоксичні,
механізми або механізми, відсутні у бактеріальних клітинах (6).
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Пряма мутація: генна мутація від материнського типу до
мутантної форми, яка спричиняє зміну або втрату ензимної
активності функції закодованого протеїну.
Мутагени заміщення пари основ: речовини, що спричиняють
заміну однієї або кількох пар основ у ДНК.
Мутагени, що викликають мутації зі зсувом рамки: речовини, що
спричиняють додавання чи делецію одиничних чи множинних пар основ
у молекулі ДНК.
Час експресії фенотипу: період, впродовж якого незмінні генні
продукти вичерпуються з клітин, що нещодавно мутували.
Частота мутацій: кількість виявлених клітин-мутантів,
поділена на кількість життєздатних клітин.
Відносне загальне зростання: збільшення кількості клітин з
часом у порівнянні з контрольною популяцією клітин; підраховуються
як продукт росту суспензії по відношенню до часу для ефективності
клонування негативної контрольної групи задля негативного
контролю.
Відносне зростання суспензії: збільшення кількості клітин за
період експресії по відношенню до негативної контрольної групи.
Життєздатність: ефективність клонування клітин, що піддаються
дії речовини, за час знаходження у чашці за селективних умов після
періоду експресії.
Виживання: ефективність клонування клітин, що піддаються дії
речовини, по завершенні періоду цієї дії; виживання, зазвичай,
виражається по відношенню до ступеню виживання у контрольній
популяції клітин.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Клітини, позбавлені тимідин-кінази (ТК) завдяки мутації
TK+/- -> TK-/- є стійкими до цитотоксичних впливів аналогу
піримідину трифлюоротимідину (ТФТ). Спеціальні клітини
тимідин-кінази чутливі до ТФТ, що спричиняє пригнічення клітинного
метаболізму та припиняє подальший поділ клітин. Таким чином,
клітини-мутанти здатні розростатися в присутності ТФТ, в той час
як звичайні клітини, що містять тимідин-кіназу, до цього нездатні.
Подібним чином, клітини, позбавлені ГГФТ або КГФТ, відбирають за
ознакою резистентності до 6-тіогуаніну (ТГ) та 8-азагуаніну (АГ).
Властивості досліджуваної речовини слід детально розглядати, якщо
випробування основного аналогу або сполуки, пов'язаної з
селективним реагентом, проводиться в рамках будь-якого тесту на
генну мутацію клітин ссавців. Наприклад, будь-яка підозрювана
вибіркова токсична дія досліджуваної речовини на мутантні або не
мутантні клітини повинна досліджуватись. Таким чином, дія
системи/реагента відбору має бути підтверджена, якщо досліджувані
хімічні речовини структурно пов'язані з селективним реагентом.
Клітини у вигляді суспензії або моношарової культури
піддаються впливу досліджуваної речовини як в присутності системи
метаболічної активації, так і за її відсутності, на відповідний
період часу та пасеруються з метою визначення цитотоксичності та
для надання змоги вираження фенотипу перед відбором
мутантів (9)(10)(11)(12)(13). Цитотоксичність, зазвичай,
визначається за допомогою вимірювання відносної ефективності
клонування (коефіцієнту виживання) або відносного показника
загального росту культур по закінченні періоду дослідження.
Культури, піддані дії речовини, утримуються в середовищі росту
впродовж достатнього періоду часу, характерного для кожного
відібраного локусу та типу клітини, з метою надання змоги
максимально наближеного до оптимального вираження фенотипу
спровокованих мутацій. Частота мутацій визначається за допомогою
висівання певного числа клітин у середовище, що містить
селективний реагент для визначення клітин-мутантів, та у
середовище без селективного реагенту для визначення ефективності
клонування (життєздатності). По завершенні відповідного періоду
інкубації колонії підраховують. Частота мутацій виводиться з
кількості колоній-мутантів у селективному середовищі та кількості
колоній у неселективному середовищі.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Клітини
Різноманітність типів клітин, доступна для використання в
цьому тесті, включає субклони клітин L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79
або TK6. Типи клітин, що використовуються в цьому тесті, повинні
мати явну чутливість до хімічних мутагенів, високу ефективність
клонування та стабільну частоту спонтанних мутацій. Клітини
потрібно перевіряти на зараження мікоплазмою; при виявленні
зараження їх не слід використовувати.
Тест має бути розроблено з урахуванням попередньо визначеної
чутливості та сили впливу. Кількість клітин, культур та
концентрацій використаної досліджуваної речовини повинна
відображати ці визначені параметри (14). Мінімальна кількість
життєздатних клітин, що переживають піддавання дії речовини і
використовуються на кожній стадії дослідження, має обумовлюватись
частотою спонтанних мутацій. Основною рекомендацією є
використовувати кількість клітин, що є принаймні вдесятеро
інверсивнішою за частоту спонтанних мутацій. Проте, рекомендується
6 використовувати щонайменше 10 клітин. Адекватні історично
встановлені дані про систему клітин мають бути доступними для
зазначення послідовних результатів дослідження.
1.4.1.2. Середовище і умови для культур
Для підтримання культур потрібно використовувати відповідне
середовище та умови вирощування (ємкості для культур, температури,
концентрації CO і вологості). Середовище слід вибирати згідно з
2 системами відбору та типу клітин, що використовувалися для
дослідження. Особливо важливо, щоб умови для культур обиралися з
забезпеченням оптимальних умов для росту клітин під час періоду
експресії та здатності формувати колонії як мутантних, так і не
мутантних клітин.
1.4.1.3. Підготовка культур
Клітини розводяться з вихідної культури, висіваються в
культуральне середовище та вирощуються при 37 град.C. Перед
проведенням тесту культури можуть потребувати очищення від раніше
існуючих мутантних клітин.
1.4.1.4. Метаболічна активація
Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як
в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за
її відсутності. Найчастіше використовується система доповненої
коферментами пост-мітохондріальної фракції (S9), приготованої з
печінок гризунів, оброблених ензимами, включаючи такі агенти, як
Арохлор-1254 (15)(16)(17)(18) або суміш фенобарбіталу та
нафтофлавону (19)(20).
Пост-мітохондріальна фракція, зазвичай, використовується в
концентраціях в діапазоні від 1-10% в об'ємному співвідношенні в
кінцевому піддослідному середовищі. Вибір та стан системи
метаболічної активації можуть залежати від класу хімічних речовин,
що випробовуються. В деяких випадках може бути доцільним
використання більш ніж однієї концентрації пост-мітохондріальної
фракції.
Кількість подій, включаючи створення ліній клітин, що
експресують специфічні аміноацил-РНК-синтетази, за допомогою
генної інженерії, може надати потенціал для ендогенної активації.
Вибір ліній клітин для використання має бути науково виправданим
(наприклад, відповідністю цитохрому P450 ізоензиму для метаболізму
досліджуваної речовини).
1.4.1.5. Досліджувана речовина/Підготовка
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або довести до
стану суспензії за допомогою відповідного розчинника або
середовища і розбавити, якщо це є доцільним, перед обробкою
клітин. Рідкі досліджувані речовини можна додавати безпосередньо
до досліджуваних систем та/або розбавити перед введенням. Слід
застосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тільки
дані щодо стабільності не виявляють прийнятності зберігання.
1.4.2. Умови тестування:
1.4.2.1. Розчинник/середовище:
Не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовища
з досліджуваною речовиною, вони також повинні бути придатними для
виживання клітин і сумісними з діяльністю S9. Якщо
використовується не добре відомий розчинник/середовище, їх
включення має підтверджуватись даними, що доводять їхню
сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати
спочатку водний розчинник/середовище. При тестуванні речовин,
нестабільних при взаємодії з водою, використовувані органічні
розчинники не мають містити води. Воду можна усунути шляхом
додавання молекулярного сита.
1.4.2.2. Концентрація для впливу
При визначенні найвищої концентрації слід розглянути такі
критерії, як цитотоксичність, розчинність в досліджуваних системах
та зміни pH або осмотичного тиску.
Цитотоксичність потрібно визначати в присутності та за
відсутності метаболічної активації в ході основного експерименту,
використовуючи відповідний показник цілісності та росту клітин,
такий, як відносна ефективність клонування (життєздатність) або
відносний показник загального росту. Можливо, буде корисним
визначення цитотоксичності та розчинності в ході підготовчого
експерименту.
Потрібно використати щонайменше чотири концентрації,
придатних до аналізування. У випадку цитотоксичності три
концентрації повинні покривати діапазон від максимальної до
незначної або відсутньої токсичності; це зазвичай означає, що
рівні концентрації мають бути відділені більше, ніж фактором між
2 та Кк 10. Якщо максимальна концентрація визначається на основі
цитотоксичності, вона має складати приблизно 10-20% (але не менше
10%) відносної життєздатності (відносної ефективності клонування)
або відносного показника загального росту. Для відносно не
цитотоксичних речовин максимальна концентрація для проведення
тесту має становити 5 мг/мл, 5 мю л/мл або 0,01 Моль, яка є
найнижчою.
Відносно нерозчинні речовини слід випробовувати до їх межі
розчинності, використовуючи відповідні умови для культур. Докази
нерозчинності мають визначатися в останньому досліджуваному
середовищі, в якому клітини піддавали впливу. Може бути корисно
оцінити розчинність на початку і в кінці тестування, тому що
розчинність може змінюватися протягом періоду впливу в
досліджуваній системі завдяки присутності клітин, S9, сироватки, і
т.д. Нерозчинність можна визначити неозброєним оком. Осад не
повинен змінювати результати оцінювання.
1.4.2.3. Контрольні групи
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (за
розчинником або середовищем), як з метаболічною активацією, так і
без неї, мають входити до складу кожного експерименту. При
використанні метаболічної активації хімічна речовина, що
використовується для позитивної контрольної групи, має бути такою,
що вимагає активації для мутагенної реакції.
До речовин для позитивного контролю належать:
------------------------------------------------------------------ | Умови для | Локус | Речовина | Номер | Номер | |метаболічної| | | РСХ | ЄРІКХР | | активації | | | | | |------------+---------+--------------------+---------+----------| |Відсутність |ГГФТ |Етилметансульфонат | 62-50-0 | 200-536-7| |екзогенної | |--------------------+---------+----------| |метаболічної| |Етилннитрозосечовина|759-73-9 | 212-072-2| |активації |---------+--------------------+---------+----------| | |ТК |Метилметансульфонат | 66-27-3 | 200-625-0| | |(маленькі| | | | | |та великі| | | | | |колонії) | | | | | |---------+--------------------+---------+----------| | |КГФТ |Етилметансульфонат | 62-50-0 | 200-536-7| | | |--------------------+---------+----------| | | |Етилннитрозосечовина|759-73-9 | 212-072-2| |------------+---------+--------------------+---------+----------| |Присутність |ГГФТ |3-метилхолантрен | 56-49-5 | 200-276-4| |екзогенної | |--------------------+---------+----------| |метаболічної| |N-нітрозодиметиламін| 62-75-9 | 200-549-8| |активації | |--------------------+---------+----------| | | |7,12- | 57-97-6 | 200-359-5| | | |диметилбензантрацен | | | | |---------+--------------------+---------+----------| | |ТК |Циклофосфамід | 50-18-0 | 200-015-4| | |(маленькі|--------------------+---------+----------| | |та великі|Циклофосфаміду |6055-19-2| | | |колонії) |моногідрат | | | | | |--------------------+---------+----------| | | |Бензо(альфа)пірен | 50-32-8 | 200-028-5| | | |--------------------+---------+----------| | | |3-метилхолантрен | 56-49-5 | 200-276-5| | |---------+--------------------+---------+----------| | | КГФТ |N-нітрозодиметиламін| 62-75-9 | 200-549-8| | | |(для високих рівнів | | | | | |S-9) | | | | | |--------------------+---------+----------| | | |Бензо(альфа)пірен | 50-32-8 | 200-028-5| ------------------------------------------------------------------
Можна використати інші відповідні еталонні речовини для
позитивного контролю, якщо, наприклад, в лабораторії є історична
база даних з 5-бромо-2'-дезоксиуридину (номер РСХ 59-14-3, номер
ЄРІКХР 200-415-9), ця еталонна речовина також може бути
використана. За наявності може розглядатись застосування хімічної
речовини, що використовується для позитивного контролю з огляду на
клас.
Негативна контрольна група, що складається окремо з
розчинника або середовища у досліджуваному середовищі, якому
вводяться ті ж речовини, що і досліджуваним групам, також має бути
включена. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалися впливу
досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщо немає
історично встановлених даних з контролю, що показують відсутність
шкідливих та мутагенних впливів обраного розчинника.
1.4.3. Процедура
1.4.3.1. Введення досліджуваної речовини
Клітини, що розростаються, потрібно піддати впливу
досліджуваної речовини як за участю, так і без метаболічної
активації. Дія речовини має тривати відповідний період часу
(зазвичай, ефективним є період від трьох до шести годин). Період
дії можна подовжити на один або більше клітинних циклів.
При кожній випробуваній концентрації можуть використовуватись
як подвійні, так і одиночні культури. При використанні одиночних
культур кількість використовуваних концентрацій слід збільшити з
метою забезпечення достатньої кількості культур для аналізу
(наприклад, принаймні вісім концентрацій, придатних до
аналізування). Слід використовувати подвійні культури для
негативного (за розчинником) контролю.
Газоподібні та летючі речовини випробовуються за допомогою
відповідних методів, таких як запечатані ємкості для
культур (21)(22).
1.4.3.2. Вимірювання частоти виживання, мутацій та
життєздатності
По закінченні періоду впливу клітини змивають та вирощують з
метою визначення частоти виживання та визначення вираження
мутантного фенотипу. Вимірювання цитотоксичності за допомогою
визначення відносної ефективності клонування (життєздатності) або
відносного показника загального росту культур, зазвичай, починають
по закінченні періоду дослідження.
Кожний локус має визначені мінімальні часові вимоги для
наближеного до оптимального вираження фенотипу новоутворених
мутантів (ГГФТ та КГФТ вимагають щонайменше 6-8 днів, а ТК -
щонайменше 2 дні). Клітини вирощують у середовищі як із
селективним реагентом (реагентами), так і без нього (них) з метою
визначення кількості мутантів та ефективності клонування,
відповідно. Вимірювання життєздатності (що використовується для
підрахунку частоти мутацій) починається по закінченні періоду
вираження; для цього клітини поміщають в чашку з неселективним
середовищем.
Якщо досліджувана речовина дає позитивну реакцію у тестуванні
на L5178Y TK+/-, потрібно провести калібрування колоній принаймні
щодо однієї з досліджуваних культур (в найвищій позитивній
концентрації) та в негативній та позитивній контрольних групах.
Якщо досліджувана речовина дає негативну реакцію у тестуванні на
L5178Y TK+/-, потрібно провести калібрування колоній в негативній
та позитивній контрольних групах. У дослідженнях з використанням
TK6TK+/- також можна використовувати калібрування колоній.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Дані повинні включати визначення цитотоксичності та
життєздатності, підрахунки колоній та частоти мутацій для
досліджуваних та контрольних культур. Якщо досліджувана речовина
дає позитивну реакцію у тестуванні на L5178Y TK+/-, колонії
оцінюють, використовуючи критерії малих та великих колоній на
принаймні одній концентрації досліджуваної речовини (в найвищій
позитивній концентрації) та на негативній та позитивній
контрольних групах. Молекулярну та цитогенетичну природу мутантів
як у малих, так і у великих колоніях, було детально
досліджено (23)(24). У тестуванні на TK+/-колонії оцінюють,
використовуючи критерії колоній з нормальним ростом (великих) та з
повільним ростом (малих). Для мутантних клітин, що зазнали
усебічних генетичних пошкоджень, час подвоєння збільшується і,
таким чином, відбувається формування малих колоній. Ці
пошкодження, зазвичай, знаходиться у проміжку від повних генних до
видимих у каріотипах хромосомних аберацій. Провокування появи
мутантів малих колоній було пов'язано з хімічними речовинами, які
викликають значні хромосомні аберації (26). Менш уражені
клітини-мутанти доростають до розмірів материнських клітин і
формують великі колонії.
Слід надати дані про життєздатність (відносну ефективність
клонування) або відносний показник загального росту. Частота
мутацій повинна виражатись у вигляді кількості клітин-мутантів по
відношенню до кількості клітин, що вижили.
Потрібні індивідуальні дані. Також всі дані повинні бути
підсумовані у формі таблиці.
Немає вимог щодо перевірки чіткої позитивної реакції.
Сумнівні результати мають перевірятися шляхом проведення подальших
досліджень, переважно з використанням модифікації
експериментальних умов. Негативні результати потрібно
підтверджувати в окремих випадках. У випадках, коли підтвердження
негативних результатів не вважається необхідним, потрібно навести
обґрунтування. Модифікація параметрів дослідження з метою
розширення діапазону оцінюваних умов буде розглядатися в подальших
експериментах як з сумнівним, так і з негативним результатом.
Параметри дослідження, що можуть бути модифіковані, включають в
себе просторовий розподіл концентрації та умови метаболічної
активації.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату,
такі як збільшення, пов'язане з концентрацією, або відтворюване
збільшення частоти мутацій. Перш за все необхідно враховувати
біологічну релевантність результатів. Можливе використання
статистичних методів в якості допоміжних при оцінюванні
результатів тестування. Статистична значимість не має бути єдиним
фактором, що визначає позитивну реакцію.
Досліджувана речовина, результати тестування якої не
відповідають вищезазначеним критеріям, вважається немутагенною в
цій системі.
Хоча більшість досліджень дає чітко позитивні або негативні
результати, в поодиноких випадках сукупність даних виключає
можливість визначеного судження про активність досліджуваної
речовини. Результати можуть залишатись сумнівними або
проблематичними, не зважаючи на кількість повторень експерименту.
Позитивні результати тесту in vitro на генну мутацію клітин
ссавців означають, що досліджувана речовина викликає генні мутації
у використаних для тестування культивованих клітинах ссавців.
Позитивна відтворювана реакція на концентрацію є більш значущою.
Негативні результати означають, що в умовах тестування
досліджувана речовина не викликає генних мутацій у використаних
для тестування культивованих клітинах ссавців.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості, звіт про проведення тестування має містити
наступну інформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору середовища/розчинника,
- розчинність та стабільність досліджуваної речовини в
розчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Клітини:
- тип і джерело клітин,
- кількість клітинних культур,
- кількість клітинних пасажів, у випадку застосування,
- метод збереження культури клітин, у випадку застосування,
- відсутність мікоплазми.
Умови тестування:
- обґрунтування для вибору концентрацій і кількості культур,
включаючи, наприклад, дані про цитотоксичність та обмеження щодо
розчинності, якщо вони є доступними,
- склад середовища, концентрація CO ,
2
- концентрація досліджуваної речовини,
- об'єм середовища і доданої досліджуваної речовини,
- температура вирощування,
- час вирощування,
- тривалість дії речовини,
- щільність клітин під час дії речовини,
- тип і склад системи метаболічної активації, включаючи
прийнятності,
- позитивні та негативні контрольні групи,
- тривалість періоду вираження (включаючи кількість висіяних
клітин, субкультур та графіки федінгу, якщо це є доцільним),
- селективні реагенти,
- критерії віднесення тестування до позитивного, негативного,
або сумнівного розряду,
- методи, використані для рахування кількості життєздатних
клітин та клітин-мутантів,
- визначення колоній, розмір і тип яких розглядалися
(включаючи визначення "малих" та "великих" колоній, якщо це є
доцільним).
Результати:
- ознаки токсичності,
- ознаки преципітації,
- дані про pH та осмотичний тиск впродовж періоду введення
досліджуваної речовини, якщо визначено,
- розмір колонії, якщо він оцінювався, принаймні для
негативної та позитивної контрольних груп,
- компетентність лабораторії для визначення мутантів малих
колоній за допомогою системи L5178Y TK+/-, де це доцільно,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичний аналіз, якщо він має місце,
- паралельні дані позитивних та негативних контрольних груп
(розчинник або середовище),
- історично встановлені дані позитивних та негативних
контрольних груп (розчинник або середовище), з діапазонами,
середніми показниками та стандартними відхиленнями,
- частота мутацій.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall,
K.R. (Eds.), (1987) Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis,
Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
(2) Chu, E.H.Y. and Malling, H.V., (1968) Mammalian Cell
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in
Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61,
p. 1306-1312.
(3) Liber, H.L. and Thilly, W.G., (1982) Mutation Assay at
the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation
Res., 94, p. 467-485.
(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and
Dearfield, K.L., (1989) Differential Mutant Quantitation at the
Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, p. 394-403.
(5) Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F., (1989) Comparison of
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug
Candidates. Mutation Res., 223, p. 121-128.
(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M.,
Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E.,
(1994) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report.
Report of the International Workshop on Standardisation of
Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, p. 235-239.
(7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.,
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity Under
Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9.
Mutation Res., 257, p. 147-204.
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and
Mavournin, K.H., (1983) Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in
Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency
Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, p. 225-251.
(9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S.,
(1988) A Review and Analysis of the Chinese Hamster
Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to
Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase
III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program.
Mutation Res., 196, p. 17-36.
(10) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta,
R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski,
L.F.Jr. and Yang, L.L., (1987) A Guide for the Performance of the
Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl
Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, p. 135-141.
(11) Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B., (1989) A
Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human
Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an
Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation
Res., 216, p. 9-17.
(12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W.,
(1986) Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl
Methanosulphonate-and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl
Methanosulphonate-and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells.
Mutation Res., 160, p. 133-147.
(13) Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D., (1984)
Procedures for the L5178Y/TK+/- - TK+/- Mouse Lymphoma Cell
Mutagenicity Assay. В: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of
Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New
York, p. 239-268.
(14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L.,
Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C., (1989) Mammalian Cell
Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. В: Statistical
Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed.,
Cambridge University Press, p. 66-101.
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R.,
Loprieno, N. and Mazzaccaro, A., (1977) Induction of
6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by
Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation
Res., 46, p. 365-373.
(16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methods
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the
Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res.,
31, p. 347-364.
(17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G.
and Brown M.M.M., (1979) Validation and Characterisation of the
L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59,
p. 61-108.
(18) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for
the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.
(19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse,
D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992)
Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity
Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T.,
(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an
Inducer of Metabolic Activation Systems. В: In vitro Metabolic
Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R.,
Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland,
p. 85-88.
(21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982)
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile
Liquids. В: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds).
Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91-103.
(22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L.,
(1983) Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the
CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5,
p. 795-801.
(23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A.
and Hozier, J.C., (1990) Molecular Dissection of Mutations at the
Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 51-55.
(24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E.,
Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J., (1985) Analysis of
Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse
Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, p. 161-174.
(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B., (1990)
Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a
Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229,
p. 89-102.
(26) Moore, M.M. and Doerr, C.L., (1990) Comparison of
Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient
Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells.
Mutagenesis, 5, p. 609-614.

B.18. ПОШКОДЖЕННЯ ТА РЕПАРАЦІЯ ДНК - НЕРЕПАРТИВНИЙ
СИНТЕЗ ДНК - КЛІТИНИ ССАВЦІВ IN VITRO
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Тест на нерепаративний синтез ДНК (НСД) визначає синтез
репарації ДНК після ексцизії та усунення ділянки ДНК, що містить
зону з пошкодженням, спричиненим хімічними та фізичними агентами.
Тест ґрунтується на введенні тимідину, міченого тритієм (3H-TdR),
в ДНК клітин ссавців, які знаходяться не в S-фазі клітинного
циклу. Поглинання 3H-TdR може визначатись за допомогою
авторадіографії або сцинтиляційного рахунку (СР) ДНК, взятої з
клітин, що піддавалися дії речовини. Клітини ссавців у культурі,
якщо тільки вони не є первинними гепатоцитами щурів, піддаються
дії випробуваних агентів як в присутності екзогенної системи
метаболічної активації, так і за її відсутності. НСД також може
вимірюватись в системах in vivo.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Досліджувані хімічні речовини та контрольні або еталонні
речовини потрібно готувати в середовищі росту, розчинити або
усунути за допомогою відповідного середовища, а потім розбавити у
середовищі росту для використання в процесі аналізу. Остаточна
концентрація середовища не повинна впливати на життєздатність
клітин.
Первинні культури гепатоцитів щурів, лімфоцитів людини або
усталених ліній клітин (наприклад, диплоїдних фібробластів людини)
можуть використовуватись для аналізу.
Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічної
речовини як в присутності відповідної системи метаболічної
активації, так і за її відсутності.
Умови тестування:
Кількість клітин
Для кожної експериментальної точки необхідні принаймні дві
клітинні культури для визначення НСД за допомогою авторадіографії
і шість (або менше, якщо це є науково виправданим) - за допомогою
СР.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (без
піддавання впливу досліджуваної речовини/або за середовищем), як з
метаболічною активацією, так і без неї, мають входити до складу
кожного експерименту.
Приклади позитивного контролю для аналізу гепатоцитів щурів
включають 7,12-диметилбензатрацен (7,12-ДМБА) або
2-ацетиламінофлуорен (2-ААФ). Випадок використання усталених ліній
клітин 4-нітроквінолін-N-оксид (4-НКО) є прикладом для позитивного
контролю як для авторадіографічного, так і для СР-аналізу, що
проводиться без метаболічної активації; N-диметилнітрозамін є
прикладом сполуки для позитивного контролю за умови використання
систем метаболічної активації.
Концентрація для впливу
Потрібно використовувати різні концентрації досліджуваної
речовини у відповідному діапазоні, що дозволяє визначити реакцію.
Найвища концентрація може викликати певні цитотоксичні ефекти.
Відносно нерозчинні в воді сполуки потрібно тестувати до їх межі
розчинності. Для нетоксичних хімічних речовин, що вільно
розчиняються у воді, найвища досліджувана концентрація
визначається для кожного окремого випадку.
Клітини
Для підтримання культур потрібно використовувати відповідне
середовище росту, концентрацію CO , температуру і вологість.
2 Усталені лінії клітин потрібно періодично перевіряти на зараження
мікоплазмою.
Метаболічна активація
Система метаболічної активації не використовується з
первинними культурами гепатоцитів. Усталені лінії клітин та
лімфоцити повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як в
присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за
її відсутності.
Процедура
Підготовка культур
Усталені лінії клітин генеруються з вихідних культур
(наприклад, шляхом трипсинізації або відриву), що висіваються в
ємкості для культур за відповідної щільності та інкубуються при
температурі 37 град.C.
Короткострокові культури гепатоцитів щурів створюються за
допомогою способу, що дозволяє щойно розчиненим у відповідному
середовищі гепатоцитам приєднуватись до поверхні, що росте.
Культури лімфоцитів людини готують шляхом використання
відповідних технік.
Піддавання культур дії досліджуваної речовини
Первинні гепатоцити щурів
Щойно ізольовані гепатоцити щурів піддають дії досліджуваної
речовини в середовищі, що стримує 3H-TdR на певний період часу.
Наприкінці періоду введення речовини середовище виливається з
ємкості, де знаходяться клітини, які потім промивають, фіксують та
висушують. Мікроскопічні препарати потрібно занурити у
авторадіографічну емульсію (можна використати як альтернативу
плівку зі зйомною емульсією), піддати впливу речовини, проявити,
зафарбувати та підрахувати.
Усталені лінії клітин і лімфоцити
Техніки авторадіографії: клітинні культури піддають впливу
досліджуваної речовини впродовж певного періоду, після чого їх
піддають дії 3H-TdR. Час визначається, виходячи з природи
речовини, активності систем метаболізму та типу клітин. Щоб
визначити пік НСД, слід додати 3H-TdR або одночасно з
досліджуваною речовиною, або через кілька хвилин після введення
досліджуваної речовини. На вибір між цими двома процедурами можуть
впливати можливі взаємодії між досліджуваною речовиною та 3H-TdR.
Для визначення різниці між НСД та напівконсервативною реплікацією
ДНК, останню слід інгібітувати, наприклад, шляхом використання
аргінін-недостатнього середовища, низького вмісту сироватки або
гідроксикарбаміду в культуральному середовищі.
Ср-вимірювання НСД: перед введенням досліджуваної речовини
входження клітин в S-фазу слід блокувати, як описано вище; потім
клітини слід піддати впливу досліджуваних хімічних речовин, як
описано в процедурі для авторадіографії. Наприкінці інкубаційного
періоду ДНК потрібно вилучити з клітин і визначити загальний вміст
ДНК та об'єм 3H-TdR з визначеною інкорпорацією.
Слід зазначити, що, коли у вищезазначених техніках
використовуються лімфоцити людини, пригнічення напівконсервативної
реплікації ДНК не є необхідним для культур, які не було піддано
стимуляції.
Аналіз
Авторадіографічні визначення
Про визначенні НСД в клітинах культури ядра S-фази не
підраховуються. Потрібно підрахувати щонайменше 50 клітин на
концентрацію. Мікроскопічні препарати перед підрахунком слід
закодувати. На кожному мікроскопічному препараті потрібно
обрахувати декілька віддалених випадкових полів. Кількість
інкорпорацій 3H-TdR в цитоплазму повинна визначатись шляхом
обрахування трьох зон ядра певних розмірів в цитоплазмі кожної
обрахованої клітини.
Визначення СР
Для кожної концентрації і в контрольних групах для визначення
СР методом НСД слід використовувати достатню кількість культур.
Всі результати потрібно підтверджувати шляхом незалежного
експерименту.
2. ДАНІ
Дані мають бути представлені у формі таблиці.
2.1. АВТОРАДІОГРАФІЧНІ ВИЗНАЧЕННЯ
Об'єм 3H-TdR в цитоплазмі та кількість гранул, знайдених на
клітинному ядрі, повинні фіксуватись окремо.
Для описання розподілу об'єму 3H-TdR в цитоплазмі та
кількості гранул на ядро можливе використання середнього
показника, медіани та моди.
2.2. ВИЗНАЧЕННЯ СР
Для визначень СР інкорпорація 3H-TdR має вноситись до звіту,
як кількість розпадків на хвилину/мг ДНК. Середня кількість
розпадків на хвилину/мг ДНК зі стандартним відхиленням може
використовуватись для опису розподілу інкорпорації.
Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичний
метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості звіт про проведення тестування має містити
наступну інформацію:
- клітини, що використовувались, щільність та кількість
пасажів за час дії речовини, кількість клітинних культур,
- методи, що використовувались для збереження клітинних
культур, включаючи середовище, температуру і концентрацію CO ,
2
- досліджувану речовину, середовище, концентрації та
обґрунтування для вибору концентрацій, використаних для аналізу,
- детальний опис систем метаболічної активації,
- графік введення,
- позитивні та негативні контрольні групи,
- техніки авторадіографії, що використовувались,
- процедури, що використовувались для блокування входження
клітин в S-фазу,
- процедури, що використовувались для вилучення ДНК та
визначення загального вмісту ДНК у межах визначення СР,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичну оцінку,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.19. АНАЛІЗ ОБМІНУ СЕСТРИНСЬКИМИ
ХРОМАТИДАМИ IN VITRO
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Аналіз обміну сестринськими хроматидами (ОСХ) є
короткостроковим дослідженням на визначення взаємних обмінів ДНК
між двома сестринськими хроматидами хромосоми, що знаходяться у
процесі дуплікації. ОСХ являють собою взаємний обмін продуктами
реплікації ДНК на ймовірно гомологічних локусах. Процес обміну,
ймовірно, включає в себе розрив і возз'єднання ДНК, хоча про
молекулярну основу цих процесів є мало відомостей. Виявлення ОСХ
вимагає деяких середніх значень для сестринських хроматид, яким
надаються окремі етикетки, що може досягатися інкорпорацією
бромдезоксиуридину (БДУ) в хромосомну ДНК для двох клітинних
циклів.
Клітини ссавців in vitro піддаються впливу досліджуваної
хімічної речовини як з екзогенною системою метаболічної активації
у ссавців, так і без неї, якщо це є доцільним, і вирощуються
культури за два цикли реплікації в середовищі, що містить БДУ.
Після піддавання дії інгібітору веретена (наприклад, колхіцину)
для накопичення клітин у метафазоподібній стадії мітозу
(с-метафазі) клітини збирають і роблять хромосомні препарати.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
- Первинні культури (лімфоцити людини) або усталені лінії
клітин (наприклад, клітини яєчників китайського хом'яка) можуть
використовуватись для аналізу. Лінії клітин потрібно перевіряти на
зараження мікоплазмою.
- потрібно використовувати відповідне середовище та умови
вирощування (наприклад, температуру, ємкості для культур,
концентрацію CO і вологість).
2
- досліджувані речовини можуть бути приготовані у
культуральному середовищі, розчинені або доведені до стану
суспензії у відповідних середовищах перед обробкою клітин.
Остаточна концентрація середовища в культуральній системі не
повинна відчутно впливати на життєздатність клітин та їх рівень
росту, а впливи на частоту ОСХ можна відслідковувати за допомогою
контролю розчинника.
- клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини
як в присутності екзогенної системи метаболічної активації у
ссавців, так і за її відсутності. Як альтернатива, там, де
використовуються типи клітин із внутрішньою метаболічною
активністю, рівень та природа активності має відповідати
досліджуваному класу хімічних речовин.
1.6.2. Умови тестування:
Кількість клітин
Для кожної експериментальної точки потрібно використовувати
щонайменше подвійні культури.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Позитивні контрольні групи з використанням як сполуки прямої
дії, так і сполуки, що вимагає метаболічної активації, повинні
бути включені у кожний експеримент, також потрібно проводити
контроль за середовищем.
Нижче наведено приклади речовин, що можуть використовуватися
для позитивного контролю:
- сполука прямої дії:
- етилметансульфонат,
- сполука непрямої дії:
- циклофосфамід.
Якщо це є доцільним, можливе включення додаткового
позитивного контролю для того самого хімічного класу, що й хімічна
речовина, що тестується.
Концентрація для впливу
Потрібно використовувати щонайменше три концентрації
досліджуваної речовини з адекватними проміжками між ними. Найвища
концентрація повинна обумовити значний токсичний вплив, але не має
впливати на адекватність реплікації клітин. Відносно нерозчинні в
воді речовини слід тестувати до межі розчинності з використанням
відповідних процедур. Для нетоксичних речовин, що вільно
розчиняються у воді, найвища концентрація досліджуваної речовини
визначається для кожного окремого випадку.
1.6.3. Процедура
Підготовка культур
Усталені лінії клітин генеруються з вихідних культур
(наприклад, шляхом трипсинізації або відриву), що висіваються в
ємкості для культур за відповідної щільності та інкубуються при
температурі 37 град.C. Для моношарових культур кількість клітин на
ємкість слід відрегулювати таким чином, щоб культури зливалися не
набагато більше, ніж на 50% на час збору. В якості альтернативи,
клітини можуть використовуватись у суспензійній культурі. Культури
лімфоцитів людини готують шляхом застосування відповідних технік
та вирощуються при температурі 37 град.C.
Піддавання дії речовини
Клітини в експоненціальній фазі росту піддають впливу
досліджуваної речовини на відповідний період часу; в більшості
випадків ефективність досягається за 1-2 години, але у певних
випадках період дії можна подовжити до двох повних клітинних
циклів. Клітини з достатньою внутрішньою метаболічною активністю
повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічної речовини як в
присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за
її відсутності. По закінченні періоду впливу з клітин змивають
досліджувану речовину та вирощують культури за два цикли
реплікації за наявності БДУ. В якості альтернативної процедури,
клітини можна одночасно піддавати впливу досліджуваної хімічної
речовини та БДУ на повний період вирощування культури, що складає
два клітинних цикли.
Культури лімфоцитів людини піддають дії речовини, коли вони
знаходяться в напівсинхронному стані.
Клітини аналізують на етапі другого поділу після дії
речовини, щоб переконатись, що найбільш чутливі стадії клітинного
циклу було піддано впливу хімічної речовини. З усіма культурами,
до яких додається БДУ, слід працювати в темряві або при тьмяному
світлі від ламп розжарювання до моменту збору клітин з метою
мінімізації фотолізу ДНК, що містить БДУ.
Збір клітин
Клітинні культури піддають дії інгібітору веретена
(наприклад, колхіцину) впродовж часу від 1 до 4 годин до моменту
збору. Кожну культуру збирають і обробляють окремо для підготовки
хромосом.
Підготовка хромосомних препаратів і зафарбовування хромосом
Хромосомні препарати роблять за допомогою стандартних
цитогенетичних технік. Зафарбовування мікроскопічних препаратів
може здійснюватись з використанням декількох технік (наприклад,
флуоресценція плюс метод Гімза).
Аналіз
Кількість клітин, підданих аналізу, має засновуватися на
спонтанній контрольній частоті ОСХ. Як правило, для ОСХ аналізують
щонайменше 25 метафаз, що добре розрослися, на культуру.
Мікроскопічні препарати отримують перед аналізом. В лімфоцитах
людини аналізуються тільки метафази, що містять 46 центромерів. В
усталених лініях клітин аналізуються тільки метафази, що містять
+- 2 центромери модального числа. Слід зазначити, чи мала місце
центромерна зміна етикетки, оцінена як ОСХ. Результати потрібно
підтверджувати шляхом незалежного експерименту.
2. ДАНІ
Дані мають бути представлені у формі таблиці. Кількість ОСХ
для кожної метафази та кількість ОСХ на хромосому для кожної
метафази має вноситись до списку окремо для всіх піддослідних і
контрольних культур.
Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичний
метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості звіт про проведення тестування має містити
наступну інформацію:
- клітини, що використовувались, метод збереження культури
клітин,
- умови тестування: склад середовища, концентрація CO ,
2
концентрація досліджуваної речовини, використане середовище,
температура інкубації, період дії, використаний інгібітор
веретена, його концентрація і тривалість його введення,
використаний тип системи активації клітин ссавців, позитивні та
негативні контрольні групи,
- кількість клітинних культур на експериментальну точку,
- детальний опис техніки, що використовувалась для підготовки
мікроскопічних препаратів,
- кількість проаналізованих метафаз (дані наводяться окремо
для кожної культури
),
- середня кількість ОСХ на клітину і на хромосому (дані
наводяться окремо для кожної культури
),
- критерії для оцінки ОСХ,
- обґрунтування вибору дози,
- співвідношення дози і реакції, у випадку застосування,
- статистичну оцінку,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.20. РЕЦЕСИВНИЙ ТЕСТ НА ЛЕТАЛЬНІСТЬ, ПОВ'ЯЗАНУ
ЗІ СТАТЕВИМИ ВІДМІННОСТЯМИ, У ДРОЗОФІЛИ ЧОРНОЧЕРЕВОЇ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИПИ МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Рецесивний тест на летальність, пов'язану зі статевими
відмінностями (РЛСВ) у дрозофіли чорночеревої, виявляє випадки
мутацій, як точкових, так і невеликих делецій, у зародкових лініях
комах. Цей тест є аналізом подальшої мутації, що здатний до
скринінгу на мутації приблизно у 800 локусах у X-хромосомі, що
являє собою біля 80% всіх локусів X-хромосоми. X-хромосома являє
собою приблизно одну п'яту частину всього галоїдного геному.
Мутації у X-хромосомі дрозофіли чорночеревої є фенотиповими
та виражені у комах чоловічої статі, носіїв мутантного гена. Коли
мутація є летальною у гемізиготному стані, висновок про її
присутність робиться, спираючись на відсутність одного класу
нащадків-самців з двох, які були нормально народжені
гетерозиготною самицею. РЛСВ-тест користується перевагами,
наданими цими фактами, використовуючи особливим чином мічені та
упорядковані хромосоми.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Лінії
Можна використовувати самців чітко визначеної лінії дикого
типу та самиць лінії Мюллер-5. Також можна використовувати
відповідним чином позначені лінії самиць із множинними
інвертованими X-хромосомами.
Досліджувана речовина
Досліджувані речовини слід розчинити у воді. Речовини, які є
нерозчинними у воді, можна розчинити або усунути за допомогою
відповідного середовища (наприклад, суміші етанолу та Tween-60 або
80), потім розбавити водою або фізіологічним розчином перед
введенням. Слід уникати диметилсульфоксиду (ДМСО) у якості
середовища.
Кількість тварин
Тест має бути розроблено з урахуванням попередньо визначеної
чутливості та сили впливу. Частота спонтанних мутацій, що
спостерігається у відповідній контрольній групі, дуже впливатиме
на кількість хромосом, підданих дії речовини, що є об'єктом
аналізу.
Маршрут введення
Вводити речовину можна перорально, за допомогою ін'єкції або
з використанням газів і пароподібних речовин. Федінг досліджуваної
речовини може здійснюватися у розчині цукру. За необхідності,
речовини можна розчинити у 0,7%-розчині NaCl та вприснути у грудну
клітину чи черевну порожнину.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Слід залучати до тестування негативні (за середовищем) та
позитивні контрольні групи. Проте, у випадку наявності відповідних
історично встановлених даних з контролю, в паралельних контрольних
групах потреби немає.
Рівні впливу
Потрібно використовувати три рівні впливу. Для попередньої
оцінки можна використати один рівень впливу досліджуваної
речовини, який є рівнем максимально допустимої концентрації або
таким, що викликає певні ознаки токсичності. Для нетоксичних
речовин слід використовувати вплив максимальної застосовної
концентрації.
Процедура
Самців дикого типу (віком від 3 до 5 днів) піддають дії
досліджуваної речовини та індивідуально спарюють з надлишком
незапліднених самиць лінії Мюллер-5 або іншої відповідно
маркованої (із множинними інвертованими X-хромосомами) лінії.
Самиць замінюють на свіжих незапліднених кожні 2-3 дні, щоб
охопити весь зародковий цикл клітини. Нащадків цих самиць оцінюють
з точки зору летальних впливів, що відповідають впливам на зрілу
сперму, сперматиди на середній або пізній стадії, сперматиди на
ранній стадії, сперматоцити та сперматогонії під час дії речовини.
Гетерозиготні самиці F1 з вищенаведеного схрещування можуть
спарюватись індивідуально (тобто, одна самиця на пробірку) з їх
братами. В поколінні F2 кожна культура оцінюється за критерієм
відсутності самців дикого типу. Якщо здається, що культура
походить від самиці F1, що є носієм летальної батьківської
X-хромосоми (тобто, не спостерігається самців з хромосомою, що
була піддана дії речовини), дочок цієї самиці з тим самим
генотипом слід протестувати, щоб встановити, чи летальність
повторюється у наступному поколінні.
2. ДАНІ
Дані мають бути внесені в таблицю таким чином, щоб
відобразити кількість піддослідних X-хромосом, кількість
безплідних самців та кількість летальних хромосом для кожної
концентрації впливу та для кожного періоду спарювання кожного
піддослідного самця. Потрібно повідомляти про кількість скупчень
різних розмірів на самця. Результати потрібно підтверджувати
шляхом окремого експерименту.
Для оціночних рецесивних летальних тестів на базі статевих
відмінностей слід використовувати відповідні статистичні методи.
Потрібно розглянути і оцінити в певному статистичному ключі
утворення скупчень рецесивних летальних генів, що походять від
одного самця.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості звіт про проведення тестування має містити
наступну інформацію:
- лінія: використовувані лінії чи штами, вік комах, кількість
піддослідних самців, кількість безплідних самців, кількість
утворених культур F2, кількість культур F2 без потомства,
кількість хромосом, що є носіями виявленого летального гену у
кожному зародковому циклі клітини.
- критерії визначення розміру піддослідних груп,
- умови тестування, детальний опис введення речовини та
графік вибірки, рівень введення, дані щодо токсичності, негативних
(за середовищем) та позитивних контрольних груп, якщо це є
доцільним,
- критерії для оцінки летальних мутацій,
- співвіднесення дози/реакції, де можливо,
- оцінка даних,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.21. ТЕСТИ IN VITRO НА ТРАНСФОРМАЦІЮ
КЛІТИН ССАВЦІВ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Системи культур клітин ссавців можна використовувати для
виявлення змін фенотипу in vitro, спричинених хімічними
речовинами, і пов'язаних зі злоякісною трансформацією in vivo.
Широко використовуються такі клітини, як C3H10T1/2, 3T3, SHE,
клітини щурів, що досліджують за методом Фішера; дослідження
ґрунтуються на змінах морфології клітин, формуванні фокусу або
змінах якірної залежності в напівтвердому агарі. Існують менш
широко використовувані системи для визначення фізіологічних або
морфологічних змін в клітинах внаслідок піддавання впливу
канцерогенних хімічних речовин. Жодна з кінцевих точок тесту in
vitro не має встановленого механістичного зв'язку з раком. Деякі з
тестових систем здатні визначати провокуючі пухлини фактори.
Цитотоксичність може визначатися за допомогою вимірювання впливу
досліджуваного матеріалу на здатність до формування колоній
(ефективність клонування) або швидкість росту культур. Вимірювання
цитотоксичності полягає у встановленні того факту, що введення
досліджуваної хімічної речовини було токсикологічно доцільним, але
воно не може використовуватись для підрахунку трансформації:
частота в усіх аналізах з деяких пір може включати подовжену
інкубацію та/або повторний посів на чашках.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Клітини
Різноманітність ліній клітин або первинних клітин доступна в
залежності від тесту на трансформацію, що використовується.
Дослідник має переконатись у тому, що клітини у тесті, що
проводиться, демонструють відповідні зміни фенотипу після
піддавання їх впливу відомих канцерогенів і що тест, який
проводиться в лабораторії дослідника, є вагомим та надійним, що
доведено документально.
Середовище
Середовище та умови експерименту повинні відповідати методу
аналізу трансформацій, що використовується.
Досліджувана речовина
Досліджувані речовини можуть бути приготовані у
культуральному середовищі, розчинені або усунені у відповідні
середовища перед обробкою клітин. Остаточна концентрація
середовища в культуральній системі не повинна впливати на
життєздатність клітин та їх швидкість росту або ступінь
трансформацій.
Метаболічна активація
Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як
в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за
її відсутності. В якості альтернативи, коли використовуються типи
клітин із внутрішньою метаболічною активністю, має бути відомо, що
рівень та природа активності відповідає досліджуваному класу
хімічних речовин.
Умови тестування:
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Позитивні контрольні групи з використанням як сполуки прямої
дії, так і сполуки, що вимагає метаболічної активації, повинні
бути включені у кожний експеримент, також потрібно використовувати
негативний контроль за середовищем.
Нижче наведено приклади речовин, що можуть використовуватися
для позитивного контролю:
- Хімічні речовини прямої дії:
- Етилметансульфонат,
- бета-пропіолактон.
- Сполуки, які потребують метаболічної активації:
- 2-ацетиламінофлуорен,
- 4-диметиламіноазобензен,
- 7,12-диметилбензантрацен.
Якщо це є доцільним, потрібне включення додаткового
позитивного контролю для того самого хімічного класу, що й
сполука, яка тестується.
Концентрація для впливу
Потрібно використовувати декілька концентрацій досліджуваної
речовини. Ці концентрації мають призводити до токсичних впливів,
пов'язаних з концентрацією, найвища концентрація, що спричиняє
низький рівень виживання, а показник виживання при найнижчій
концентрації є приблизно таким самим, як і у негативній
контрольній групі. Відносно нерозчинні в воді речовини потрібно
випробовувати до межі розчинності з використанням відповідних
процедур. Для нетоксичних речовин, що вільно розчиняються у воді,
найвища концентрація досліджуваної речовини визначається для
кожного окремого випадку.
Процедура
Клітини повинні піддаватись впливу на відповідний період часу
в залежності від системи випробування, що використовується, і в
цей період може входити повторне введення дози, яке
супроводжується зміною середовища (і, за необхідності,
приготуванням свіжої суміші для метаболічної активації), якщо
період впливу подовжується. Клітини без достатньої внутрішньої
метаболічної активності повинні піддаватись впливу досліджуваної
речовини як в присутності відповідної системи метаболічної
активації, так і за її відсутності. По закінченні періоду впливу з
клітин змивають досліджувану речовину та вирощують культури,
забезпечуючи умови, потрібні для появи трансформованого фенотипу,
що спостерігається, та визначеного ступеню трансформацій. Всі
результати підтверджуються шляхом незалежного експерименту.
2. ДАНІ
Дані мають бути представлені у формі таблиці і можуть
відображатися у різних формах, в залежності від методу аналізу,
який використовується, наприклад, чашкові підрахунки, позитивні
чашки або кількість трансформованих клітин. Де це доцільно,
виживання виражається у відсотковому співвідношенні контрольних
рівнів, а частота трансформацій - як кількість трансформантів на
кількість одиниць, що вижили. Дані слід оцінювати, використовуючи
відповідний статистичний метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості звіт про проведення тестування має містити
наступну інформацію:
- тип клітин, що використовувались, кількість клітинних
культур, методи збереження клітинних культур,
- умови тестування: концентрація досліджуваної речовини,
використане середовище, тривалість інкубації, тривалість та
частота введення, щільність клітин під час дії речовини, тип
використаної системи екзогенної метаболічної активації, позитивні
та негативні контрольні групи, специфікація фенотипу, що
спостерігається, використана система відбору (якщо це є
доцільним), обґрунтування вибору дози,
- методи, використані для підрахунку кількості життєздатних
та трансформованих клітин,
- статистичну оцінку,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.22. ТЕСТ НА ДОМІНУВАННЯ
ЛЕТАЛЬНИХ НАСЛІДКІВ У ГРИЗУНІВ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Домінування летальних наслідків спричиняє смерть ембріону або
зародку. Індукція домінування летальних наслідків через вплив
хімічної речовини означає, що речовина спричинила пошкодження
зародкової тканини піддослідних видів. Те, що домінування
летальних наслідків обумовлено хромосомними пошкодженнями,
(структурними та кількісними аномаліями), є загальноприйнятим
фактом. Смерть ембріону при введенні речовини самицям також може
бути результатом токсичних впливів.
Як правило, самців піддають впливу досліджуваної сполуки, а
потім вони спарюються з незаплідненими самицями, яким не вводили
речовину. Різні зародкові цикли клітини можуть досліджуватись
окремо з використанням послідовних інтервалів між спарюваннями.
Збільшення кількості мертвих імплантатів на самицю в піддослідній
групі по відношенню до мертвих імплантатів на самицю в контрольній
групі відображає постімплантаційну втрату. Передімплантаційна
втрата може оцінюватись, засновуючись на підрахунку жовтих тіл або
на порівнянні загальної кількості імплантатів на самицю в
піддослідній та контрольній групах. Загальне домінування летальних
наслідків є сукупністю перед- та післяімплантаційних втрат.
Підрахунок загального домінування летальних наслідків засновується
на порівнянні кількості імплантатів на самицю в піддослідній групі
по відношенню до живих імплантатів на самицю у контрольній групі.
Зменшення кількості імплантатів у певних інтервалах може бути
результатом лізису клітин (тобто, сперматоцитів та/або
сперматогоніїв).
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Якщо це можливо, досліджувані речовини слід розчинити або
довести до стану суспензії за допомогою ізотонічного
фізіологічного розчину. Хімічні речовини, які є нерозчинними у
воді, можна розчинити або довести до стану суспензії за допомогою
відповідного середовища. Використане середовище не має як
взаємодіяти з досліджуваною хімічною речовиною, так і спричиняти
токсичних впливів. Слід застосовувати свіжі препарати
досліджуваної хімічної речовини.
Умови тестування:
Маршрут введення
Досліджувана сполука, як правило, може вводитися тільки один
раз. Може застосовуватись і повторний графік введення, що
засновується на токсикологічній інформації. Звичайними шляхами
введення є пероральна інтубація або інтраперитонеальна ін'єкція.
Можуть бути доцільними інші шляхи введення.
Піддослідні тварини
Дослідження рекомендується проводити на мишах або щурах.
Здорових і повністю статевозрілих тварин відбирають навмання і
розподіляють в піддослідну і контрольну групи.
Кількість і стать
Повинна використовуватись достатня кількість піддослідних
самців, беручи до уваги спонтанні варіації біологічного характеру,
що оцінюються. Обрана кількість має ґрунтуватись на заздалегідь
визначеній чутливості до виявлення та силі значущості. Наприклад,
у типовому тесті кількість самців у кожній групі в залежності від
дози повинна бути достатньою для забезпечення запліднення від
30 до 50 самиць за інтервал спарювання.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Як правило, паралельні позитивні та негативні контрольні
групи (за середовищем) мають входити до складу кожного
експерименту. Якщо прийнятні результати позитивної контрольної
групи отримані в результаті раніше проведених у тій самій
лабораторії експериментів, ці результати можна використати замість
паралельної позитивної контрольної групи. Речовини для позитивного
контролю для демонстрації чутливості до тесту слід використовувати
у відповідному низькому дозуванні (наприклад, ММС
внутрішньобрюшинно, 10 мг/кілограм).
Рівні дозування
Зазвичай, слід використовувати три рівні впливу. Під дією
високої дози у піддослідних тварин з'являються ознаки токсичності
або зниженої фертильності. В певних випадках може бути достатньо
одноразового введення дози високого рівня.
Тестування на граничний вміст
Нетоксичні речовини повинні випробовуватись у дозі
5 мг/кілограм за одне введення або 1 г/кілограм/день,
використовуючи повторювані введення.
Процедура
Є доступними декілька графіків введення речовини. Найчастіше
використовується одноразове введення досліджуваної речовини. Можна
використати інші графіки введення.
Окремі самці послідовно спарюються з однією або двома
незаплідненими самицями, яким не вводили речовину, з відповідними
інтервалами після введення речовини. Самиць потрібно залишити з
самцями принаймні на час одного естрального циклу або до
спарювання, яке визначається наявністю сперми у вагіні або у
вагінальній пробці.
Кількість спарювань після введення речовини регулюється
графіком введення та має гарантувати, що з усіх зародкових циклів
клітини після введення речовини буде взято зразки.
Самиць знищують у другій половині вагітності, а вміст матки
досліджують на предмет визначення кількості мертвих та живих
імплантатів. Можливе проведення дослідження яєчників для
визначення кількості жовтих тіл.
2. ДАНІ
Дані мають бути внесені в таблицю таким чином, щоб
відобразити кількість вагітних самців та кількість невагітних
самиць. Про результати кожного спарювання, включаючи ідентичність
кожного самця та самиці, потрібно повідомляти окремо. Щодо кожної
самиці в тиждень спарювання потрібно фіксувати рівень дозування,
отриманий самцями, частоту виявлення живих та мертвих імплантатів.
Підрахунок загального домінантного летального ефекту
засновується на порівнянні кількості імплантатів на самицю в
піддослідній групі по відношенню до живих імплантатів на самицю в
контрольній групі. Співвідношення кількості мертвих і живих
імплантатів в піддослідній групі порівняно з тим самим
співвідношенням у контрольній групі аналізується з метою
визначення постімплантаційних втрат.
Якщо дані фіксуються із зазначенням смертності на ранніх та
на пізніх стадіях, це має бути чітко відображено у таблицях. Якщо
оцінюється передімплантаційна втрата, це має бути відображено у
звіті. Передімплантаційна втрата може розраховуватись як різниця
між кількістю жовтих тіл та кількістю імплантатів або як зменшення
середньої кількості імплантатів на матку в порівнянні з даними
контрольної групи.
Дані оцінюють, використовуючи відповідні статистичні методи.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості звіт про проведення тестування має містити
наступну інформацію:
- біологічні види, штам, вік та вага використовуваних тварин,
кількість тварин кожної статі в експериментальній і контрольній
групах,
- досліджувана речовина, середовище, досліджені рівні
дозування та обґрунтування вибору дози, позитивні та негативні
контрольні групи, дані щодо токсичності,
- шлях та графік введення,
- графік спарювання,
- метод, що використовується для визначення того, що
спарювання вже відбулося,
- час знищення,
- критерії для оцінки домінування летальних наслідків,
- співвідношення дози і реакції, у випадку застосування,
- статистичну оцінку,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.23. ТЕСТ НА ХРОМОСОМНУ СПЕРМАТОГОНІАЛЬНУ
АБЕРАЦІЮ ССАВЦІВ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 483, Тест на
Хромосомну Сперматогоніальну Аберацію Ссавців (1997).
1.1. ВСТУП
Метою тесту in vivo на хромосомну сперматогоніальну аберацію
є визначення тих речовин, які спричиняють структурні хромосомні
аберації у сперматогоніальних клітинах ссавців (1)(2)(3).
Структурні аберації можуть бути двох типів: хромосомні або
хроматидні. При використанні більшості хімічних мутагенів
спровоковані аберації належать до хроматидного типу, але
трапляються також аберації хромосомного типу. Цей метод було
розроблено не для вимірювання кількісних аберацій і, зазвичай, він
не використовується з цією метою. Хромосомні мутації та пов'язані
з ними явища є причиною багатьох генетичних хвороб людини.
Цей тест визначає хромосомні явища в сперматогоніальних
зародкових клітинах та, таким чином, очікується, що за допомогою
цього тесту можливо буде передбачити індукцію мутацій зародкових
клітин, що передаються у спадок.
Зазвичай, для цього дослідження використовуються гризуни. Цей
цитогенетичний тест in vivo визначає хромосомні аберації у
сперматогоніальних мітозах. Інші цільові клітини не є предметом
даного методу.
Для визначення аберацій хроматидного типу у
сперматогоніальних клітинах, перший мітотичний поділ, що
відбувається після введення речовини, має досліджуватись до того,
як ці ураження буде втрачено в процесі подальшого поділу клітин.
Додаткову інформацію зі сперматогоніальних стволових клітин,
підданих дії речовини, можна отримати шляхом аналізу хромосом у
фазі мітозу на аберації хромосомного типу в діакінезі метафази I,
коли піддані дії речовини клітини стають сперматоцитами.
Цей тест in vivo призначений виявити, чи мутагени соматичних
клітин також діють на зародкові клітини. Окрім того,
сперматогоніальний тест є доцільним для оцінки мутагенної загрози,
оскільки він дає змогу розглянути фактори метаболізму in vivo,
фармакокінетику та процеси репарації ДНК.
Кількість поколінь сперматогоніїв є присутнім в сім'яниках зі
спектром чутливості до впливу хімічних речовин. Таким чином,
виявлені аберації являють собою загальну реакцію
сперматогоніальних популяцій клітин, підданих дії речовини, з
домінуванням більш численних диференційованих сперматогоніальних
клітин. В залежності від їх положення в сім'яниках різні покоління
сперматогоніїв можуть або не можуть стати об'єктом загального
кровообігу через фізичний або фізіологічний бар'єр з клітин
Сертолі та гемато-тестикулярний бар'єр.
Якщо є докази того, що досліджувана речовина або реактивні
метаболіти не досягнуть цільової тканини, проведення цього
дослідження не є доцільним.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Аберація хроматидного типу: структурне хромосомне
пошкодження, що виявляється в утворенні розривів окремих хроматид
або в утворенні розривів і об'єднанні хроматид.
Аберація хромосомного типу: структурне хромосомне
пошкодження, що виявляється в утворенні розривів або в утворенні
розривів і об'єднанні обох хроматид на ідентичній ділянці.
Геп: ахроматичне ушкодження, менше за ширину хроматиди, і з
мінімальним порушенням орієнтації хроматид.
Кількісна аберація: зміна кількості хромосом відносно
характеристик нормальної кількості у використаних тварин.
Поліплоїдія: помноження галоїдної кількості хромосом (n) на
відміну від диплоїдної кількості (тобто, 3n, 4n і т.д.).
Структурна аберація: зміна в структурі хромосом, що
визначається при мікроскопічному дослідженні метафазної стадії
поділу клітини, яка спостерігається у вигляді делецій,
внутрішнього або взаємного обміну.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Тварин піддають впливу досліджуваної речовини, використовуючи
відповідний шлях введення, і знищують у зазначений час після
втручання. Перед знищенням тварин піддають дії речовин, що
спричиняють блокування метафази (наприклад, колцеміду(R) або
колхіцину). Потім виготовляють хромосомні препарати з зародкових
клітин і зафарбовують їх, і метафазні клітини аналізують на
предмет хромосомних аберацій.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Вибір біологічних видів тварин
Зазвичай, використовують самців мишей та китайських хом'яків.
Проте, можливе використання самців інших придатних біологічних
видів ссавців. Слід залучити для проведення тестувань лабораторні
лінії здорових молодих дорослих тварин, що зазвичай
використовуються. На початку дослідження коливання ваги тварин має
бути мінімальним і не перевищувати +- 20% від середньої ваги.
1.4.1.2. Умови утримання і годування
Застосовуються загальні умови викладені у Загальному вступі,
Частині B, проте, оптимальним показником вологості є 50-60%.
1.4.1.3. Підготовка тварин
Здорових молодих дорослих самців призначають в піддослідну
групу із застосуванням методу випадкового відбору. Клітки повинні
розташовуватись таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи на їх
місце розташування. Тварини ідентифікуються окремо. Тварин
пристосовують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів
до початку проведення дослідження.
1.4.1.4. Підготовка доз
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або довести до
стану суспензії за допомогою відповідного розчинника або
середовища і розбавити, якщо це є доцільним, перед обробкою
клітин. Рідкі досліджувані речовини можна ввести безпосередньо або
розбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі препарати
досліджуваної речовини, якщо тільки дані щодо стабільності не
виявляють прийнятності зберігання.
1.4.2. Умови тестування:
1.4.2.1. Розчинник/середовище:
Розчинник/середовище не повинне спричиняти токсичних впливів
при використаному рівні дозування, а також не має бути підозри на
хімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною.
Якщо використовується не добре відомі розчинники/середовища, їх
включення має підтверджуватись даними, що доводять їхню
сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати
спочатку водний розчинник/середовище.
1.4.2.2. Контрольні групи
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (з
використанням розчинника або середовища) мають входити до складу
кожного тестування. За винятком введення досліджуваної речовини,
за тваринами в контрольній групі доглядають так само, як і за
тваринами піддослідних груп.
Позитивні контрольні групи дають структурні хромосомні
аберації in vivo в сперматогоніальних клітинах при введенні у
рівнях дозування, за яких очікувалося зростання по відношенню до
вихідних даних, яке можна виявити.
Концентрації для позитивних контрольних груп слід обирати
таким чином, щоб впливи чітко проявлялися, проте, щоб ідентичність
кодованих мікроскопічних препаратів не одразу виявлялася пристроєм
для зчитування.
Можливим є варіант введення речовини позитивній контрольній
групі іншим шляхом, ніж вводилася досліджувана речовина, потім
зразок береться тільки один раз. Окрім того, за наявності, може
розглядатись застосування хімічної речовини, що використовується
для позитивного контролю з огляду на клас. До речовин для
позитивного контролю належать:
------------------------------------------------------------------ | Речовина | Номер РСХ | Номер ЄРІКХР | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Циклофосфамід | 50-18-0 | 200-015-4 | |Циклофосфаміду моногідрат | 6055-19-2 | | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Циклогексиламін | 108-91-8 | 203-629-0 | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Мітоміцин C | 50-07-7 | 200-008-6 | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Мономерний акриламід | 79-06-1 | 201-173-7 | |-------------------------------+--------------+-----------------| |Триетілнемеламін | 51-18-3 | 200-083-5 | ------------------------------------------------------------------
Негативні контрольні групи, яким вводиться тільки розчинник
або середовище, а в інших випадках вводяться ті ж речовини, що і
досліджуваним групам, мають включатися до кожного часу відбору
проб, якщо тільки не є прийнятною міжтваринна варіативність і
концентрація клітин з хромосомними абераціями виявлена завдяки
історично встановленим даним з контролю. Окрім того, контрольні
групи, що не піддавалися впливу досліджуваної речовини, теж
повинні використовуватись, якщо немає історично встановлених або
опублікованих даних з контролю, що показують відсутність шкідливих
та мутагенних впливів обраного розчинника.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Кількість тварин
Кожна піддослідна і контрольна група має включати щонайменше
п'ять придатних до аналізу самців.
1.5.2. Графік введення
Досліджувані речовини переважно вводяться один раз або двічі
(тобто за один або за два прийоми). Досліджувані речовини можуть
також вводитися розділеною дозою, тобто робиться два введення у
той самий день з перервою не більше, ніж у кілька годин, для
полегшення введення великого об'єму речовини. Інший графік
введення має бути науково виправданим.
Для групи з найвищою дозою потрібно два рази брати зразки
після піддавання дії речовини. Оскільки на кінетику клітинного
циклу може впливати досліджувана речовина, потрібно зробити один
ранній і один пізній забір зразків у часовому інтервалі від 24 до
48 годин після піддавання дії речовини. У випадку використання
інших, крім найвищого, рівнів дозування, потрібно взяти зразки
через 24 години або 1,5 тривалості клітинного циклу після
піддавання дії речовини, якщо інший час забору зразків не
вважається більш доцільним для виявлення впливів(6).
Додатково можливе використання іншого часу для забору
зразків. Наприклад, у випадку використання хімічних речовин, які
можуть викликати уповільнення хромосом, або можуть впливати на
S-незалежні ефекти, можливо, буде доцільним інший час забору
зразків(1).
Доцільність повторного графіку введення потрібно визначати
для кожного окремого випадку. Після застосування повторного
графіку введення, тварин знищують через 24 години (1,5 тривалості
клітинного циклу) після останнього введення речовини. Можливе
використання додаткового забору зразків.
Перед знищенням тваринам вколюється внутрішьобрюшинно
відповідна доза речовини, що спричиняє блокування метафази
(наприклад, колцеміду(R) або колхіцину). Після того зразки з
тварин беруться через відповідні інтервали часу. Для мишей цей
інтервал складає приблизно від трьох до п'яти годин, для
китайських хом'яків - від чотирьох до п'яти годин.
1.5.3. Рівень дозування
Якщо дальнометричне дослідження проводиться тому, що немає
наявних відповідних даних, воно має проводитися в тій самій
лабораторії з використанням тих самих біологічних видів, ліній та
режиму введення, що використовувались у основному дослідженні(7).
Якщо проявляється токсичність, для першого часу забору зразка
використовується три рівні дозування. Ці рівні дозування повинні
покривати діапазон від максимальної до незначної токсичності або
її відсутності. При подальшому заборі зразків потрібно
використовувати лише найвищу дозу. Найвища доза визначається як
доза, за якої з'являються такі ознаки токсичності, які при вищих
рівнях дозування з дотриманням того самого режиму можуть
спричинять смерть.
Речовини зі специфічними видами біологічної активності при
низьких нетоксичних дозах (такі, як гормони та мітогени) можуть
бути винятками з критеріїв встановлення дозування і мають
оцінюватись в окремих випадках. Найвища доза може також
визначатися як доза, за якої з'являються деякі показники
токсичності у сперматогоніальних клітинах (наприклад, зменшення
співвідношення сперматогоніальних мітозів у першій та другій
мейотичних метафазах; це зменшення не має перевищувати 50%).
1.5.4. Тестування на граничний вміст
Якщо тестування на одному рівні дозування, який становить
щонайменше 2000 мг/кг маси тіла/день з використанням введення за
один раз, або двох введень у той же день, не спричиняє видимих
токсичних впливів, і якщо генотоксичність не передбачається з
огляду на дані щодо структурно подібних речовин, то можливо, не
виникне необхідності в проведенні розгорнутого дослідження з
використанням трьох рівнів дозування. Очікуваний вплив на людину
може визначати потребу в використанні вищого рівня дозування під
час тестування на граничний вміст.
1.5.5. Призначення доз
Досліджувана речовина, зазвичай, вводиться з їжею,
використовуючи зонд для штучного харчування або відповідну
інтубаційну трубку, або шляхом внутрішньобрюшинної ін'єкції. Інші
шляхи введення можуть використовуватися, якщо вони є виправданими.
Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один раз з їжею або
ін'єкцією, залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм не має
перевищувати 2 мл/100 г маси тіла. Використання об'ємів, більших
за ці, має бути виправданим. За винятком подразнюючих чи
роз'їдаючих речовин, які, зазвичай, проявляють ускладнені впливи
при більшій концентрації, варіативність досліджуваного об'єму
потрібно мінімізувати шляхом пристосування концентрації до
забезпечення постійного об'єму на всіх рівнях дозування.
1.5.6. Підготовка хромосом
Одразу після знищення тварини беруться клітинні суспензії з
одного або обох тестів, піддаються впливу гіпотонічного розчину і
фіксуються. Потім клітини розподіляються по поверхні
мікроскопічних препаратів і зафарбовуються.
1.5.7. Аналіз
Потрібно проаналізувати щонайменше 100 метафаз, що добре
розрослися, на кожну тварину (мінімум 500 метафаз на групу). Їх
кількість можна зменшити, якщо спостерігається велика кількість
аберацій. Всі мікроскопічні препарати, включаючи препарати
позитивної та негативної контрольних груп, повинні отримати
незалежний код перед мікроскопічним аналізом. Оскільки процедури
фіксування часто призводять до розриву метафаз із втратою
хромосом, оцінені клітини повинні містити кількість центромерів,
що дорівнює кількості 2n +- 2.
2. ДАНІ
2.1. ПРЕДСТАВЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Дані по кожній окремій тварині повинні бути представлені у
вигляді таблиць. Експериментальною одиницею вважається тварина.
Для кожної окремої тварини необхідно оцінити кількість клітин зі
структурними хромосомними абераціями і кількість структурних
аберацій. Різні типи структурних хромосомних аберацій повинні бути
записані з їхніми номерами і частотою аберацій для групи, що
проходила лікування і для контрольної групи. Різниця записується
окремо, але, як правило, не включається до загальної частоти
аберацій.
При виявленні мітозу або мейозу, співвідношення між
сперматогеніальними мітозами і першою та другою мейотичними
метафазами визначається як значення цитотоксичності для всіх
тварин, що проходили лікування і тварин негативної контрольної
групи в зразку зі 100 клітин, що діляться, на одну тварину для
визначення можливого цитотоксичного ефекту. При виявленні мітозу,
показник мітозу повинен складати принаймні 1 000 клітин на кожну
тварину.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Існують декілька критеріїв, що визначають позитивний
результат, таких як, збільшення відносної кількості клітин з
хромосомною аберацією в залежності від дози, або безпосереднє
збільшення клітин з абераціями в одній дозі під час відбору
окремої проби. В першу чергу необхідно врахувати біологічну
актуальність результатів. Статистичні методи можуть
використовуватись в якості допоміжних методів при оцінюванні
результатів(8). Статистична значимість не повинна бути єдиним
фактором, що визначає позитивний результат. Неоднозначні
результати необхідно перевірити повторно, бажано за змінених
експериментальних умов.
Дослідна речовина, для якої результати не відповідають
вищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цьому
досліді.
Не дивлячись на те, що більшість експериментів дає однозначно
позитивні або негативні результати, в незначній кількості випадків
отримані дані виключають можливість зробити точний висновок щодо
активності дослідної речовини. Результати можуть залишатись
неоднозначними або спірними незалежно від кількості повторень
досліду.
Позитивні результати дослідження сперматогеніальної
хромосомної аберації в живому організмі показують, що дослідна
речовина викликає структурні хромосомні аберації в статевих
клітинах тварин, що досліджуються. Негативні результати показують,
що за даних умов проведення досліду, дослідна речовина не викликає
структурні хромосомні аберації в статевих клітинах тварин, що
досліджуються.
Вірогідність того, що дослідна речовина або її метаболіти
досягнуть цільової тканини має бути обговорена.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕНИЙ ДОСЛІД
Звіт про проведений дослід повинен містити наступну
інформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору розчинника,
- розчинність та стабільність дослідної речовини в
розчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Піддослідні тварини:
- породи/види, що використовувались,
- кількість і вік тварин,
- джерело, умови проживання, дієта, і т.ін.,
- вага кожної окремої тварини на початку досліду, включаючи
діапазон ваги тіла, середнє і стандартне відхилення для кожної
групи.
Умови досліду:
- дані дослідження з пошуку діапазону доз, якщо таке
проводилось,
- обґрунтування вибору дозування,
- обґрунтування способу вживання,
- опис приготування дослідної речовини,
- опис способу вживання дослідної речовини,
- обґрунтування часу на умертвіння піддослідної тварини,
- перехід від концентрації дослідної речовини для дієти/пиття
(ppm) до дійсної дози (мг/кг від ваги тіла/день), якщо
застосовується,
- дані щодо якості їжі і пиття,
- детальний опис графіку прийому і відбору зразків,
- метод вимірювання токсичності,
- ідентифікація речовини, що зупиняє метафазу, її
концентрація і період лікування,
- методи підготовки мікроскопічних препаратів,
- критерії оцінювання аберацій,
- кількість клітин, що аналізувались по кожній тварині,
- критерії оцінювання результатів як позитивних, негативних
або неоднозначних.
Результати:
- ознаки токсичності,
- індекс частоти мітозів,
- співвідношення клітин зі сперматогеніальним мітозом до
першої і другої мейотичної метафаз,
- тип і кількість аберацій, представлених окремо по кожній
тварині,
- загальна кількість аберацій на групу,
- кількість клітин з абераціями на групу,
- залежність реакції від дози, якщо можливо,
- статистичний аналіз, якщо є,
- дані паралельних негативних контрольних групп,
- історично встановлені дані негативних контрольних груп з
діапазонами, середніми показниками та стандартними відхиленнями,
- дані паралельних позитивних контрольних груп,
- зміни в плоїдності, якщо вони помітні.
Обговорення результатів,
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Adler, I.D. (1986) Clastrogenic Potential in Mouse
Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle
Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals,
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C.,
Lambert, B. And Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, p. 477-484.
(2) Adler, I.D. (1984) Cytogenetic tests in Mammals. In:
Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed.S.Vennit and
J.M.Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, p. 275-306.
(3) Evans, E.P., Breckon, G. And Ford, C.E., (1964) An
Air-Drying Method for Meotic Preparations from Mammalian Testes.
Cytogenetics and Cell Genetics, 3, p. 289-294.
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A.Gagtehouse, D.G. and
Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenic Assays, In: D.J.Kirkland
(Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures.
UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report.
Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York,
Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
(5) Yamamoto, K. And Kikuchi, Y., (1978) A New Method for
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation
Res., 52, p. 207-209.
(6) Adler, I.D. , Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J.,
Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuye, T. and Tanka N., (1914)
International Workshop on Standardization of Genotoxicity Test
Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ
Cell Tests., Mutation Res., 312, p. 313-318.
(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A.,
Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson Walker, G.,
Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M., (1992) Report of
British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society
Working group: Dose setting: In Vivo Mutagenicity Assays.
Mutagenesis, 7, p. 313-319.
(8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlet, G.E.,
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage,
J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In Vivo Cytogenic Assays
In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity
Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity
Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge,
New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184-232.

В.24. КРАПЕЛЬНИЙ ТЕСТ НА ПІДДОСЛІДНИХ МИШАХ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Цей вид тестування належить до тестування in vivo, при якому
на мишей, що виношують ембріонів діють хімічними речовинами.
Цільові клітини в ембріонах, що розвиваються є меланобластами, а
цільові гени є генами, що відповідають за пігментацію шерсті
тварини. Ембріони, що розвиваються, є гетерозиготними для окремої
кількості генів, що відповідають за колір шерсті тварини. Мутація
в домінантну алель або втрата домінантної алелі (в різних
генетичних випадках) такого гену в меланобласті призводить до
вираження рецесивного фенотипу в похідних клітинах, завдяки чому
виникають плями відмінного кольору на шерсті піддослідної миші.
Кількість потомства з такими плямами і мутації записуються, а їхня
частота порівнюється з потомством, отриманим від ембріонів, що
піддавались виключно дії розчину. Крапельний тест на піддослідних
мишах визначає очікувану соматичну мутацію в фетальних клітинах.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Якщо це можливо, дослідні речовини розчиняються або
суспендуються в ізотонічному розчині. Хімічні речовини, що не
розчиняються в воді розчиняються або суспендуються у відповідному
середовищі. Середовище, що використовується, не повинно ні
взаємодіяти з дослідним хімікатом, ні викликати токсичний ефект.
Необхідно використовувати свіжі препарати дослідного хімікату.
Піддослідні тварини
Миші штаму Т (нон-агуті, а/а4 шиншилового офарблення, з
ch ch червоними очима, c p/c p4 коричневі, b/b; димчасті, з короткими
вухами, d se/d se; зі строкатими плямами, s/s) схрещувались або з
мишами штаму НТ (безбарвні, нон-агуті, брахіоподи, ра а br/pa a
bp; сірі пухнасті миші, ln fz/ln fz; з перламутровим офарбленням
ре/ре), або з C5BL (нон-агуті а/а). Інші види схрещування, такі як
схрещування NMRI (нон-агуті, а/аж альбіноси, с/с) з DBA
(нон-агуті, а/а; коричневі b/b; безбарвні d/d) можуть
здійснюватись за умови, що в результаті від них буде отримано
потомство нон-агуті.
Кількість і стать
Відповідні жіночі особини проходили процедуру для народження
ними відповідної кількості життєздатного потомства для кожного
рівня дозування. Відповідний розмір зразка визначався за кількістю
плям, що спостерігались у мишей, що проходили процедуру і за
набором контрольних даних. Негативні результати вважались
прийнятними тільки за умови, якщо було оцінено принаймні
300 особин потомства, отриманого від жіночих особин, що отримали
найвищу дозу.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Необхідно надати дані щодо паралельної контрольної групи
мишей, що піддавалися дії середовища (негативний контроль). Можуть
бути використані історично встановлені дані контрольної групи тієї
ж лабораторії для підвищення результатів тесту за умови, що ці
дані є гомогенними. Дані, отримані щодо позитивної контрольної
групи, в тій самій лабораторії, в результаті приймання хімічної
речовини, яка відома як така, що викликає мутагенність, надаються,
якщо не виявлено мутагенності дослідної речовини.
Спосіб приймання
Звичайним способом приймання є пероральна інтубація або
інттраперітонеальна ін'єкція для вагітних жіночих особин. В разі
необхідності застосовується приймання шляхом інгаляції або іншим
способом.
Рівні доз
Застосовується щонайменш два рівні дозування, включаючи один,
що виявляє ознаки токсичності або зменшення розміру посліду. Для
нетоксичних хімікатів використовується максимальна можлива доза.
Процедура
Звичайно препарат приймається один раз на 8, 9 або 10 день
вагітності, рахуючи з дня, в який вперше було помічено вагінальну
пробку. Ці дні відповідають дням 7,25, 8,25 і 9,25 після зачаття.
В ці дні допускається прийом наступних доз.
Аналіз
Потомству присвоюються коди і проводиться його оцінювання на
предмет наявності плям в період між третім і четвертим тижнем
після народження. Розрізняють три класи плям:
(а) білі плями розміром 5 мм середньо-черевної лінії, які,
можливо є наслідком умертвіння клітин (WMVS);
b) жовті, подібні до агуті цятки, що виступають на сосках,
статевих органах, горлі, в пахвовій та паховій зонах, а також в
зоні середини лоба, які, можливо, є наслідком різниці (MDS); а
також
с) забарвлені і білі плями, безсистемно розташовані на
шерсті, які, можливо, є наслідком соматичних мутацій (RS).
Всі три класи зареєстровані як результати, але тільки
останній RS має генетичну придатність. Проблему розрізнення MDS і
RS можна розв'язати шляхом дослідження проб шерсті під
флуоресцентним мікроскопом.
Слід відзначити очевидні морфологічні відхилення, що
проявляються у потомства.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТИ З ДОСЛІДЖЕНЬ
Звіт з досліджень повинен, якщо це можливо, містити в собі
наступну інформацію:
- штами, що використовувались при схрещуванні,
- середня кількість вагітних самок в дослідній групі і
контрольних групах,
- середня кількість посліду в дослідній групі і контрольних
групах на момент народження, а також після закінчення годування,
- об'єм дози (доз) дослідної хімічної речовини,
- розчинник, що використовувався,
- день вагітності, в який було дано дослідну речовину,
- спосіб приймання дослідної речовини,
- загальна кількість потомства, що досліджується з WMVS, MDS
і RS в дослідній групі і контрольних групах,
- значні морфологічні відхилення,
- зв'язок між рівнем дози і реакцією особин з RS, якщо це
можливо,
- статистичний аналіз,
- аналіз результатів,
- інтерпретація результатів,
3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, частина В
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, частина В

В.25. СПАДКОВА ТРАНСЛОКАЦІЯ У МИШЕЙ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, частина В
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, частина В
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутня.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження спадкової транслокації у мишей показують
структурні і кількісні хромосомні зміни в зародкових клітинах
ссавців, що регенеровані в першим поколінні потомства. Типи
виявлених хромосомних змін є двосторонньою транслокацією, а також
у випадку потомства жіночої статі - втратою хромосоми Х. Носії
транслокації і самки генотипу ХО показують знижену плідність, яка
використовується при відборі потомства F з метою здійснення
1 цитогенетичного аналізу. Повна безплідність є наслідком
транслокацій певного типу (хромосом Х-аутосом і типу c-t).
Транслокації спостерігаються в мейотичних клітинах в діакінезі
метафази I у чоловічих особин, також F , самців або чоловічого
1 потомства самок F . Самки генотипу ХО цитогенічно ідентифікуються
1 завдяки наявності тільки 39 хромосом в клітинах кісткового мозку,
що проходять стадію мітозу.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Дослідну речовину розчиняють в ізотонічному розчині солі.
Хімічні речовини, що не розчиняються в воді розчиняються або
суспендуються у відповідному середовищі. Необхідно використовувати
свіжі препарати дослідного хімікату. Якщо середовище
використовується щоб полегшити введення дози, воно не повинно ні
взаємодіяти з дослідною сполукою, ні викликати токсичний ефект.
Спосіб приймання
Звичайним способом приймання є пероральна інтубація або
інттраперітонеальна ін'єкція. В разі необхідності застосовується
приймання речовини іншим способом.
Піддослідні тварини
З метою полегшення годування і цитологічної верифікації цей
дослід проводиться на мишах. Вимоги щодо штаму мишей відсутні.
Однак, середня кількість посліду повинна бути більшою за вісім
особин і бути відносно постійним.
Необхідно використовувати здорових, статево зрілих тварин.
Кількість тварин
Необхідна кількість тварин залежить від частоти спонтанних
транслокацій, а також мінімального ступеню індукцій, необхідного
для позитивного результату.
Дослідження звичайно проводиться шляхом аналізу потомства
самців F . Необхідно дослідити принаймні 500 самців потомства F в
1 1
даній групі дозування. У випадку включення самок потомства F
1
необхідно 300 самців і 300 самок.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Необхідно забезпечити доступ до даних, що отримані з
паралельних і базових контрольних груп. У випадку доступності
результатів позитивної контрольної групи, що отримані в результаті
останніх дослідів в тій самій лабораторії, ці результати можна
застосовувати замість паралельної позитивної контрольної групи.
Рівні доз
Досліджується один рівень дози, як правило, найвищий рівень
дози, що пов'язаний з мінімальним проявом токсичності, але не має
впливу на репродуктивну поведінку або виживання. Для встановлення
зв'язку між дозою і реакцією необхідно вживання двох додаткових
менших доз. Для нетоксичних хімічних речовин використовується
максимальна прийнятна доза.
Процедура
Впливання дослідною речовиною і спарювання
Вимагаються дві гармонограми приймання речовини. Найчастіше
використовується одноразовий прийом дослідної речовини. Також
можна застосовувати прийом дослідної речовини сім днів на тиждень
впродовж близько 35 днів. Кількість спарювань після закінчення
прийому речовини регулюється гармонограмою досліджень з метою
гарантованого отримання проб з усіх фаз зародкової клітини. Після
закінчення періоду спарювання самок необхідно помістити в окремі
клітки. У випадку початку родів у самок необхідно зареєструвати
дату, кількість посліду, а також стать потомства. Все потомство,
що містить в собі особини самців відзвичаюється від ссання, а
потомство, що містить жіночі особини відкидається, окрім випадків,
коли воно використовується в дослідженні.
Дослідження транслокації гетерозиготності
Застосовується один з двох можливих методів:
- дослідження плідності потомства F з наступної верифікацією
1 можливих носіїв транслокації через проведення цитогенічних
аналізів,
- цитогенічні аналізи всього чоловічого потомства F без
1 попередньої селекції шляхом дослідження плідності.
а) Дослідження плідності
Змінена плідність особини F може бути підтверджена на
1 підставі спостереження розмірів потомства і/або аналізу наявності
самок-маток.
Необхідно визначити критерії для встановлення нормальної і
зниженої плідності штаму мишей, що використовуються в досліді.
Дослідження кількості посліду: самці F , призначені для
1 дослідження розміщуються в клітках окремо від самок або з того
самого експерименту, або з колонії. Клітки оглядаються щоденно
починаючи з 18 дня після спарювання. Кількість посліду, а також
стать потомства F записується після народження, наступні посліди
2 відкидаються. У випадку дослідження жіночого потомства F
1
потомство F малих послідів зберігається з метою проведення
2 подальших дослідів. Жіночі носії транслокації перевіряються за
допомогою аналізів транслокацій у їхнього чоловічого потомства.
Самки ХО розпізнаються за зміною відношення показника статі у
їхнього потомства з 1:1 на 1:2 чоловічих особин до жіночих. В
наступній процедурі звичайні тварини F відсторонюються від
1 подальших досліджень, якщо перший послід F досяг або перебільшив
2 встановлену кількість; в зворотному випадку досліджується другий
або третій послід F .
2
Тварини F , яких не можна віднести до звичайних тварин після
1 закінчення дослідження трьох послідів F або піддаються подальшому
2 дослідженню шляхом аналізу вмісту утроби, або безпосередньо
піддаються цитогенічному аналізу.
Аналіз вмісту утроби: Зниження розміру посліду з носіями
транслокації викликане зародковою смертю, так, що високий рівень
мертвих імплантів є проявом наявності транслокації у тварин, що
досліджуються. Кожний досліджуваний самець F використовується для
1 запліднення двох або трьох самок. Факт зачаття встановлюється
шляхом щоденного ранкового контролю вагінальних пробок. Жіночі
особини умертвляються на 14-16 день, після чого реєструється
наявність живих і мертвих імплантів в їхніх утробах.
b) Цитогенічний аналіз
Препарати з яєчок готуються за допомогою техніки сушення
повітрям. Носії транслокації розпізнаються за наявністю
полівалентних конфігурацій в діакінезі метафази І в основних
сперматоцитах. Дослідження принаймні двох клітин з полівалентними
зв'язками є підставою для підтвердження того факту, що тварини
мають носій транслокації.
Всіх самців F необхідно піддати цитогенічному аналізу, якщо
1 не проводилось жодної селекції під час розмноження. Необхідно під
мікроскопом позначити мінімум 25 клітин діакінезу метафази I
даного самця. Аналіз мітотичних метафаз в сперматогоніях в
кістковому мозку вимагається у самців F з малими яєчками і
1 дефектом мейозу до діакінезу, або у самок з підозрою на наявність
генотипу ХО. Наявність незвичайно довгої і/або короткої хромосоми
в кожній з 10 клітин є доказом особливої чоловічої стерильної
транслокації (c-t типу). Деякі транслокації Х-аутосом, що
викликають чоловічу стерильність можуть бути виявлені тільки
шляхом бендингового аналізу мітотичних хромосом. Наявність
39 хромосом в усіх 10 мітозах є доказом стану ХО у жіночих особин.
2. ДАНІ
Дані необхідно представити в формі таблиці.
При кожному спарюванні необхідно реєструвати середній розмір
посліду, а також статеве співвідношення в потомстві, що походить з
батьківської пари при народженні і в період, коли тварини
відзвичаюються від ссання.
Для оцінювання плідності тварин F представляються середні
1 кількості потомства, що походить від звичайного спарювання, а
також кількість живих і неживих імплантів від кожного спарювання
особин F , де зареєстровано наявність носіїв транслокації. З метою
1 виконання аналізу вмісту утроби необхідно зареєструвати середню
кількість живих і мертвих імплантів потомства, що походить від
звичайного спарювання, а також докладні кількості живих і неживих
імплантів для кожного потомства, де зареєстровано наявність носіїв
транслокації.
Для виконання цитогенічного аналізу діакінезу метафази I,
кількість полівалентних конфігурацій, також реєструється загальна
кількість спарювань і тривалість спарювання.
Відносно безплідних особин F необхідно зареєструвати
1 загальну кількість спарювань, а також час спарювання. Необхідно
надати вагу яєчок, а також детальний опис результатів
цитогенічного аналізу.
Відносно самок ХО реєструється середня кількість посліду,
статеве співвідношення потомства F , а також результати
2 цитогенічного аналізу.
Якщо можливо, потомство F з носіями транслокації піддаються
1 попередній селекції шляхом дослідження плідності, таблиці повинні
містити в собі інформацію, скільки з цих транслокацій було
підтверджено як гетерозиготні транслокації.
Необхідно зареєструвати дані негативних і позитивних
досліджень контрольних груп.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТИ З ДОСЛІДЖЕНЬ
Звіт з досліджень повинен, якщо це можливо, містити в собі
наступну інформацію:
- штами мишей, вік тварин, вага тварин, що досліджуються,
- кількість батьківських тварин кожної статі в групі, що
досліджується і в контрольних групах,
- умови дослідження, докладний опис дослідження, дози,
розчинники, план спарювання,
- кількість і стать потомства даної самки, кількість і стать
потомства, що вигодовувалось для аналізу транслокації,
- час і критерії транслокаційного аналізу,
- кількість, а також докладний опис носіїв транслокації,
включаючи дані, що стосуються розмноження і дані, що стосуються
вмісту утроби у відповідних випадках,
- цитогенічні процедури і деталі мікроскопіного аналізу,
найкраще надати разом зі знімками,
- статистичний аналіз,
- аналіз результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, частина В
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, частина В

В.26. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ПЕРОРАЛЬНУ
ТОКСИЧНІСТЬ ПРИ ПОВТОРЮВАНІЙ ДОЗІ: 90-ДЕННЕ
ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕРОРАЛЬНОЇ ТОКСИЧНОСТІ
НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
1. МЕТОД
Цей метод дослідження субхронічної токсичності пероральним
шляхом є копією OECD TG 408 (1998).
1.1. ВСТУП
При дослідженні і оцінюванні характеристик токсичності
хімічної речовини визначення субхронічної токсичності пероральним
шляхом при вживанні повторних доз проводиться після отримання
попередньої інформації щодо токсичності в результаті 28-денних
досліджень гострої або хронічної токсичності. В результаті
90-денного дослідження отримують інформацію щодо можливої
небезпеки для здоров'я, яка, очевидно, може виникнути після
повторного прийому препарату впродовж тривалого часу, який включає
в себе момент припинення лактації і зростання до зрілості.
Дослідження надає інформацію щодо основних токсичних ефектів,
визначає органи-мішені і можливість акумуляції, а також надає
можливість оцінити рівень дози препарату, що може викликати
прихований побічний ефект, що в свою чергу може бути використано
для вибору рівнів доз для тривалих досліджень і для визначення
критеріїв безпеки для людини.
Цей метод робить особливий наголос на неврологічному аспекті
і описує вплив на імунологічну і дітородну систему. Також слід
наголосити на необхідності ретельного клінічного нагляду за
тваринами для отримання щонайповнішої інформації. Це дослідження
повинно надати можливість визначити хімічні речовини, які є
потенціальними чинниками нейротоксичного або імунологічного
ефекту, або можуть впливати на дітородні органи, що може викликати
необхідність подальшого більш глибокого дослідження.
Також дивіться Загальний вступ, частина В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Доза: є кількість речовини, що подається. Доза виражається в
масі (г, мг), або як вага дослідної речовини на одиницю маси тіла
тварини, що досліджується (наприклад, мг/кг), або як стала харчова
концентрація (ppm).
Дозування: є загальним поняттям, що включає в себе дозу,
частоту її вживання і час приймання дози.
NOAEL: є скороченням від поняття, що визначає рівень, при
якому не спостерігається шкідливих наслідків, а також є найвищим
рівнем дози, при якому не спостерігається шкідливих ефектів, які
залежать від речовини, що подаються.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Досліджувана речовина приймається перорально щодня мірними
дозами окремими групами піддослідних тварин, один рівень дози на
групу впродовж 90 днів. Впродовж періоду приймання речовини за
тваринами здійснюється ретельний нагляд на предмет виявлення ознак
токсичності. Проводиться розтин тварини, що помирають, або яких
вбивають впродовж тестування, після завершення досліду тварин, що
вижили, також вбивають, після чого проводиться їх розтин.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка тварин
Необхідно використовувати здорових тварин, що пройшли
акліматизацію в лабораторних умовах впродовж щонайменш, п'яти днів
і які не були предметом попередніх експериментальних процедур.
Піддослідні тварини повинні бути охарактеризовані за породою,
штамом, джерелом, статтю, вагою і/або віком. Тварини повинні бути
випадково відібрані для контрольних і дослідних груп. Клітки
повинні бути розташовані таким чином, щоб мінімізувати можливі
ефекти, викликані розташуванням клітки. Кожній тварині
присвоюється унікальний ідентифікаційний номер.
1.4.2. Підготовка доз
Дослідна речовина подається через зонд або з їжею чи питтям.
Метод перорального вживання залежить від мети дослідження і
фізичних/хімічних властивостей дослідного матеріалу.
При необхідності дослідна речовина розчиняється або
підвішується у відповідному середовищі. Рекомендується за
можливістю спочатку розглянути можливість використання водного
розчину/суспензії, потім олійного розчину/емульсії (наприклад, в
кукурудзяній олії), а потім використання розчинів в інших
середовищах. Для всіх середовищ, крім води, необхідно визначити
токсичні характеристики. Необхідно визначити стабільність
дослідної речовини в умовах вживання.
1.4.3. Умови проведення досліду
1.4.3.1. Піддослідні тварини
Рекомендується використовувати щурів, але також придатними є
інші породи гризунів, наприклад, миші. Необхідно використовувати
штами здорових дорослих тварин, що звичайно використовуються в
лабораторних дослідах. Вік самки повинен складати менше одного
року, вони не повинні бути вагітними. Дозування повинно
розпочатись якнайшвидше після припинення лактації, в кожному
випадку до досягнення віку дев'яти тижнів. На початку дослідження
зміна ваги тварин повинна бути мінімальною і не перевищувати
+- 20% середньої ваги для кожної статі. У випадку, коли
дослідження проводяться в якості попередніх досліджень перед
вивченням хронічної довготривалої токсичності, для обох досліджень
необхідно використовувати тварин того самого штаму і джерела.
1.4.3.2. Кількість і стать
Принаймні 20 тварин (10 самців і 10 самок) необхідно
використовувати для кожного рівня дози. Якщо планується умертвіння
впродовж досліду, кількість необхідно збільшити на кількість
тварин, що планується вмертвити до закінчення дослідження.
Спираючись на попередній досвід про хімічні і близькі до них
речовини необхідно розглянути можливість включення додаткової
сателітної групи кількістю 10 тварин (по 5 кожної статі) для
контрольної групи і групи, що отримує найвищу дозу з метою нагляду
після досліду на предмет реверсивності або тривалості будь-яких
токсичних наслідків. Час такого нагляду встановлюється у
відповідності до виявлених наслідків.
1.4.3.3. Рівні доз
Використовуються принаймні три рівні доз з одночасним
поточним контролем, окрім випадку проведення досліду на граничний
вміст (див. 1.4.3.4.). Рівні доз визначаються на підставі
повторної дози, або на підставі досліджень діапазону, а також
повинні враховувати всі існуючі токсикологічні і
токсикоз-кінетичні дані, доступні щодо існуючої речовини або
пов'язаних з нею матеріалів. Враховуючи обмеження, викликані
фізико-хімічною природою і біологічним ефектом дослідної речовини,
рівень найвищої дози вибирається з метою викликання токсичних
проявів, але вибрана доза не повинна призводити до смерті або
значних ушкоджень. Зменшення дозування застосовується з метою
демонстрації реакції, пов'язаної з дозуванням і рівня при якому не
спостерігається шкідливих наслідків (NOAEL) при найнижчій дозі.
Двократні або чотирикратні інтервали є оптимальними для
встановлення рівнів дозування, що знижуються, а введення четвертої
дослідної групи є часто необхідним при використанні дуже значних
інтервалів (наприклад, більше ніж коефіцієнт 6-10) між
дозуваннями.
Контрольною групою повинна бути група, яка не піддається дії
препарату, або яка піддається дії середовища, якщо для вживання
дослідної речовини використовується середовище. Тварини в
контрольній групі поза часом ненадання їм дослідної речовини
знаходяться в тих самих умовах, що і тварини в дослідних групах.
Якщо використовується середовище-носій, контрольна група повинна
отримати його в максимально можливому об'ємі. Якщо дослідна
речовина подається з харчуванням і призводить до зменшення
раціону, контрольна група з харчової пари може бути корисною при
розрізненні між зменшенням, що викликане смаком і зменшенням,
викликаним токсикологічними змінами в моделі дослідження.
Наступні характеристики середовища-носія та інших добавок
повинні розглядатись як відповідні: вплив на засвоюваність,
розподіл, метаболізм, або утримання дослідної речовини; вплив на
хімічні якості дослідної речовини, що можуть змінити її токсичні
характеристики; і вплив на споживання їжі або води або харчового
статусу тварин.
1.4.3.4. Дослід на граничний вміст
Якщо тестування при одному Рівні доз, еквівалентному
1 000 мг/кг маси тіла/день при використанні процедур, описаних для
цього досліду призводить до непомітного шкідливого ефекту, а також
якщо наявність токсичності не очікується на підставі даних щодо
структурно-пов'язаних речовин, в проведенні повного дослідження
трьох рівнів доз нема необхідності. Дослід на граничний вміст
застосовується за винятком ситуацій, коли небезпека для людей
викликає потребу застосування вищого рівня дози.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Вживання доз
Тваринам надається дослідна речовина через сім днів кожного
тижня впродовж 90 днів. Кожний інший спосіб дозування, наприклад,
п'ять днів на тиждень вимагає обґрунтування. Якщо дослідна
речовина подається через зонд, процедура виконується поданням
одиничної дози з використанням трубки або катетера. Максимальний
об'єм рідини, що надається за один раз, залежить від розміру
піддослідної тварини. Об'єм не повинен перевищувати 1 мл/100 г
маси тіла, окрім випадків використання водного розчину, при яких
використовуються водні розчини з пропорцією 2 мл/100 г маси тіла.
За виключенням речовин, що викликають подразнення або корозію, які
звичайно викликають загострення при більш значних концентраціях,
необхідно мінімізувати змінність об'єму дослідної речовини шляхом
регулювання концентрації для того, щоб забезпечити постійність
об'єму на всіх рівнях дозування.
Для речовин, які подаються з їжею або питною водою, важливо
забезпечити, щоб об'єм дослідної речовини не перешкоджав
нормальному харчуванню або водному балансу. Якщо дослідна речовина
подається з їжею - застосовується або постійна концентрація в їжі
(ppm), або постійний рівень дози відносно маси тіла тварини; якщо
застосовуються альтернативні варіанти, це повинно бути зазначено
окремо. Для речовин, які подаються через зонд, доза повинна
подаватись кожного дня в той самий час і регулюватись таким чином,
щоб забезпечити постійний рівень дозування відносно маси тіла
тварини. При проведенні попереднього 90-денного дослідження перед
дослідженням токсичності, в обох випадках повинна застосовуватись
та сама дієта.
1.5.2. Огляди
Період нагляду повинен складати щонайменш 90 днів. Для тварин
в сателітній групі складається графік оглядів, при цьому у
відповідний період тварини не піддаються дії препарату для
виявлення їхньої стійкості до токсичного ефекту або здатності
відновлюватись після нього.
Загальні клінічні огляди проводяться принаймні раз на день,
бажано в один і той самий час, приймаючи до уваги піковий період
очікуваного ефекту після дозування. Клінічний стан тварин
необхідно реєструвати. Принаймні два рази на день, звичайно, на
початку і в кінці кожного дня всі тварини оглядаються на предмет
клінічних проявів і смертності.
Принаймні раз перед першим проявом (в межах порівняння) і
один раз на тиждень після цього всі тварини повинні пройти
ретельне клінічне обстеження. Ці обстеження проводяться за межами
клітки, де живе тварина, бажано в стандартному місці і в один і
той самий час. Результати повинні бути ретельно записані, бажано
використовувати систему балів, створену лабораторією, яка
проводить тестування. Необхідно докласти зусиль для забезпечення
мінімальних змін умов огляду. Виявлені прояви повинні включати в
себе зміну шкіри, хутра, очей, слизистих оболонок, наявність
секреції і екскрецій, а також автономної активності (наприклад,
очі, що сльозяться, пілоерекція, зміна розміру зіниць, зміна
дихання), але не обмежуватись ними. Необхідно також зареєструвати
такі прояви, як: зміна ходи, постави і реакції на догляд, а також
наявність клонічних або тонічних рухів, стереотипної поведінки
(надмірне вмивання, повторюваний рух по колу) або аномальної
поведінки (наприклад, нанесення собі ушкоджень, рух задом
наперед) (1).
Офтальмологічні дослідження за допомогою офтальмоскопу або
подібного приладу повинно здійснюватись перед вживанням доз
досліджуваної речовини і після закінчення дослідів, найкраще для
всіх тварин, але принаймні в групі з високим рівнем дозування і в
контрольній групі. При виявленні змін в очах, необхідно повторно
дослідити всіх тварин.
До завершення періоду дії, але в жодному випадку не раніше
ніж на 11 тиждень необхідно провести дослідження сенсорної
реактивності на різні типи дії(1) (наприклад, слухова, візуальна і
пропріоцептивна дія) (2), (3), (4), також необхідно провести
оцінку сили стискання і оцінку моторної діяльності (6). Наступні
деталі процедур, які можуть бути проведені після цього описані у
відповідних посиланнях. Однак, можуть бути використані також
альтернативні процедури.
Функціональні спостереження, що повинні бути проведені до
кінця досліду можуть бути опущені, якщо дані, отримані на основі
функціональних спостережень при проведенні інших дослідів і
щоденних клінічних оглядів не виявляють функціонального дефіциту.
В окремих випадках функціональні огляди також можуть бути
опущені для груп, що проявляють ознаки токсичності в ступеню, що
може значно вплинути на результати функціонального досліду.
1.5.2.1. Вага тіла і споживання їжі/води
Всіх тварин зважують принаймні раз на тиждень. Оцінювання
об'єму споживання їжі проводиться принаймні раз на тиждень. Якщо
дослідна речовина приймається з водою, також принаймні раз на
тиждень необхідно оцінити об'єм споживання води. Споживання води
також приймається до уваги при дослідах, де речовина подається з
їжею або через зонд, впродовж яких режим прийому води може бути
змінено.
1.5.1.1. Гематологія і клінічна біохімія
Зразки крові відбираються з зазначеного місця і зберігаються,
якщо це необхідно, у відповідних умовах. На кінець дослідного
періоду зразки збираються до або в процесі процедури для
умертвіння тварин.
Необхідно виконати наступні гематологічні дослідження в кінці
дослідного періоду після того, як зібрані проміжні проби крові:
гематокрит, концентрація гемоглобіну, кількість еритроцитів,
загальна і диференційна кількість лейкоцитів, кількість
тромбоцитів і час/потенціал згортання крові.
На пробах крові кожної тварини необхідно провести визначення
клінічної біохімії для основних досліджень токсичних наслідків в
тканинах, а саме має бути визначена: дія на нирки і внутрішні
органи, ця процедура проводиться також перед або в процесі
умертвіння тварин (відділення від тих, що помирають і/або вбиті в
продовж досліду). Подібно до гематологічних досліджень може бути
виконано відбір проб в ході досліджень для проведення клінічних
біохімічних дослідів. Рекомендується утримування тварин впродовж
ночі до відбору проб крові (1). При аналізі в плазмі або сироватці
необхідно визначити наявність: натрію, калію, глюкози, загальний
обсяг холестерину, сечовини, азоту сечовини крові, креатиніну,
загальний обсяг протеїну і альбуміну, а також два або більше
ензими, що вказують на печінково-клітковий ефект (такі як аланін
амінотрансфераза, аспартат амінотрансфераза, алкалін фосфатаза,
гама глуматил транспептидаза і сорбітолдегідрогеназа). Також може
бути проведено оцінювання кількості додаткових ензимів
(печінкового або іншого походження) і жовчних кислот, в результаті
якого в окремих випадках можна отримати корисну інформацію.
---------------- (1) Для проведення окремих досліджень сироватки і плазми,
особливо на предмет наявності глюкози, бажано утримання тварин від
їжі впродовж ночі. Основною причиною такого утримання є те, що
розбіжність результатів, отриманих при неутриманні тварин від їжі,
може приховати ефект, що важко виявити і таким чином, створити
труднощі при інтерпретації результатів. З іншого боку, утримання
від їжі впродовж ночі може вплинути на загальний метаболізм тварин
і, зокрема, при поданні дослідної речовини з харчуванням, може
змінити щоденний вплив дослідної речовини. При застосуванні
утримання від їжі впродовж ночі, необхідно виконати клінічні
біохімічні дослідження після проведення функціонального огляду.
Факультативно можна провести аналіз сечі, яка відбирається у
відповідності до визначеного графіку, впродовж останнього тижня
дослідження, в результаті такого аналізу оцінюється: зовнішній
вигляд, об'єм, осмолялність або питома густина, рН, наявність
білку, глюкози і крові, кров'яних клітин.
Також до уваги приймаються результати дослідження стану
сироватки на предмет виявлення загальних ушкоджень шкіри. Інші
речовини повинні бути визначені, якщо відомі властивості речовини
можуть або існують підозри, що вони можуть впливати на метаболізм,
такими речовинами є: кальцій, фосфор, тривалі тригліцериди,
специфічні гормони, метагемоглобін і холінестраза. Наявність цих
речовин визначається для хімікатів окремих класів або в кожному
конкретному випадку.
Взагалі необхідно застосовувати гнучкий підхід в залежності
від порід і ефекту від даної речовини, що виявляється і/або
передбачається.
Якщо історичні вихідні дані не відповідають вимогам,
необхідно звернути увагу на те, чи є необхідність до початку
дозування у визначенні гематологічних змінних і змінних клінічної
біохімії; взагалі не рекомендується отримання цих даних до початку
дослідження (7).
1.5.2.3. Загальний розтин
Всі піддослідні тварини підлягають повному детальному
загальному розтину, який включає в себе детальне вивчення
зовнішньої поверхні тіла, всіх отворів, а також черепної, грудної
і черепної порожнин і їхнього вмісту. Печінку, нирки, надниркові
залози, яєчка, придатки, матку, яєчники, зобну залозу, селезінку,
мозок і серце всіх тварин (крім тих, які вмирають і/або були
випадково вбиті) необхідно обробити клейкою тканиною, після цього
вони повинні якнайшвидше після розтину бути зважені в мокрому
стані для уникнення висихання.
Наступні тканини повинні бути законсервовані в найбільш
придатному середовищі, що є придатним для тканин обох типів і
запланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальні
ушкодження, мозок (всі репрезентативні ділянки, включаючи півкулі
головного мозку і спинний мозок/варулієв міст), хребет (на трьох
рівнях: шийному, середньо-грудному і поперековому), слизові
оболонки, щитовидні залози, паращитовидні залози, зобні залози,
стравохід, слинні залози, шлунок, великий и малий кишечник
(включаючи Пейерові бляшки), печінку, підшлункову залозу, нирки,
надпечінкову залозу, селезінку, серце, трахею і легені
(законсервовані шляхом наповнення фіксатором і занурення), аорту,
гонади, матки, інші статеві органи, жіночі грудні залози,
простату, сечовий міхур, жовчний міхур (миша), лімфатичні вузли
(бажано один лімфатичний вузол, що покриває шлях прийому
препарату, а другий вузол такий, що знаходиться на відстані від
шляху прийому препарату для, того, щоб послідкувати систематичний
вплив), периферійний нерв (сідничний або тибіальний) бажано
якнайближче до м'язу, ділянку кісткового мозку (і/або свіжий
аспірат кісткового мозку), шкіру, очі (якщо спостерігались зміни
впродовж офтальмологічного дослідження). Клінічні та інші
результати можуть викликати необхідність дослідження додаткових
тканин. Також повинні бути збережені будь-які органи, що можуть
вважатись органами-мішенями на підставі відомих властивостей
дослідної речовини.
1.5.2.4. Гістопатологія
Необхідно провести повну гістопатологію збережених органів і
тканин всіх тварин контрольної групи і групи, що отримувала
найбільшу дозу. Ці дослідження проводяться для тварин всіх інших
груп дозування при наявності змін в групі, що отримувала найбільшу
дозу, пов'язаних з дією препарату.
Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.
При використанні сателітної групи проводиться гістопатологія
на тканинах і органах, визначених, як такі, що реагують, в групах,
що приймали препарат.
2. ДАНІ І ЗВІТНІСТЬ
2.1. ДАНІ
Необхідно представити індивідуальні дані. Додатково всі дані
повинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальна
кількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількість
тварин, що вмерли під час досліду або кількість тварин, яких
безболісно умертвили, а також час, впродовж якого настала смерть
або безболісне умертвіння, кількість тварин, що має ознаки
отруєння, опис ознак отруєння, що спостерігаються, включаючи час
появи, тривалість, ступінь тяжкості кожного токсичного випадку,
кількість тварин, у яких виявлено патологічні зміни, тип
патологічних змін і відсоток тварин, що складає кожний тип
патологічних змін.
В окремих випадках кількісні результати повинні оцінюватись
відповідними і загальноприйнятими статистичними методами.
Статистичні методи і данні, що піддаються аналізу, повинні
вибиратись під час приготування проекту досліджень.
2.1.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформацію:
2.2.1. Речовина, що вживається при дослідженні:
- фізичний характер, чистота і фізико-хімічні властивості,
- ідентифікаційні дані,
- середовище (якщо застосовується): обґрунтування вибору
середовища, якщо відрізняється від води.
2.2.2. Види тварин, що використовуються при дослідженні:
- породи і штам, що використовувались,
- кількість, вік і стать тварин,
- джерело, умови проживання, харчування і т.ін.,
- вага кожної тварини на початку дослідження.
2.2.3. Умови дослідження:
- раціональне обґрунтування вибраного рівня дозування,
- докладна інформація щодо складу дослідної
речовини/приготування їжі, прийнята концентрація, стабільність і
однорідність приготування,
- докладна інформація щодо подачі дослідної речовини,
- дійсна доза (мг/кг вага тіла/день), показник конверсії
їжа/питна вода концентрації дослідної речовини (ppm) до дійсної
дози, якщо застосовується,
- докладна інформація щодо якості їжі і води.
2.2.4. Результати:
- вага тіла і зміна ваги тіла,
- споживання їжі і пиття, якщо застосовується,
- реакція на отруєння згідно зі статтю і рівнем дози,
включаючи ознаки отруєння,
- характер, ступінь і час тривання клінічних ознак
(виліковний або невиліковний стан),
- результати офтальмологічного досліду,
- оцінка сенсорних характеристик або стискання і моторних
характеристик (якщо можна оцінити),
- гематологічні дослідження з відповідними допусками рівнів,
- біохімічні клінічні дослідження з відповідними допусками
рівнів,
- остаточна вага тіла, вага органів і пропорції ваги
орган/тіло,
- результати розтину,
- детальний опис гістопатологічних результатів,
- дані, що стосуються засвоєння, якщо доступні,
- статистична обробка результатів, де необхідно.
Обговорення результатів.
Висновки.
3. ПОСИЛАННЯ
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of
Neurotixicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental
Health Criteria Document No. 60.
(2) Tupper, D.E., Wallace R.B. (1980). Utility of the
Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40,
pp. 999-1003.
(3) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in
Industrial Toxicology. J.Toxicol. Envorin. Health, 9, pp. 691-704.
(4) Moser, V.C, Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational
Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl.
Pharmacol., 108, pp. 267-283.
(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T, (1979). A
Method for Routine Assessment of Fore-and Hind-limb grip Strength
of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233-236.
(6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W.,
Reiter L.W., Tilson H. A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13,
pp. 599-609.
(7) Weingard K., Brown G., Hall R. Et al. (1996).
"Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and
Safety Studies", Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198-201.

В.27. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ПЕРОРАЛЬНУ
ТОКСИЧНІСТЬ ПРИ ПОВТОРЮВАНІЙ ДОЗІ: 90-ДЕННЕ
ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕРОРАЛЬНОЇ ТОКСИЧНОСТІ
НЕ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
1. МЕТОД
Цей метод дослідження субхронічної токсичності пероральним
шляхом є копією OECD TG 409 (1998).
1.1. ВСТУП
При дослідженні і оцінюванні характеристик токсичності
хімічної речовини визначення субхронічної токсичності пероральним
шляхом при вживанні повторних доз проводиться після отримання
попередньої інформації щодо токсичності в результаті 28-денних
досліджень гострої або хронічної токсичності. В результаті
90-денного дослідження отримують інформацію щодо можливої
небезпеки для здоров'я, яка, очевидно, може виникнути після
повторного прийому препарату впродовж тривалого часу, який включає
в себе момент припинення лактації і зростання до зрілості.
Дослідження надає інформацію щодо основних токсичних ефектів,
визначає органи-мішені і можливість акумуляції, а також надає
можливість оцінити рівень дози препарату, що може викликати
прихований побічний ефект, що в свою чергу може бути використано
для вибору рівнів доз для тривалих досліджень і для визначення
критеріїв безпеки для людини.
Це дослідження надає можливість визначити негативні наслідки
при дії хімічного препарату у тварин, що не належать до гризунів,
цей метод використовується тільки:
- у випадку, коли результати, отримані в інших дослідах,
вимагають пояснення/характеристики для іншого виду тварин, що не є
гризунами, або
- у випадку, коли токсикологічні дослідження показують, що
використання цього виду тварин, що не є гризунами, є найбільш
оптимальним вибором серед лабораторних тварин, або
- у випадку, коли інші відповідні причини доводять
необхідність використання тварин, що не є гризунами.
Також дивіться Загальний вступ, частина В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Доза: є кількістю речовини, що подається. Доза виражається в
масі (г, мг), або як вага дослідної речовини на одиницю маси тіла
тварини, що досліджується (наприклад, мг/кг), або як стала харчова
концентрація (ppm).
Дозування: є загальним поняттям, що включає в себе дозу,
частоту її вживання і час приймання дози.
NOAEL: є скороченням від поняття, що визначає рівень, при
якому не спостерігається шкідливих наслідків, а також є найвищим
рівнем дози, при якому не спостерігається шкідливих ефектів, які
залежать від речовини, що подаються.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Досліджувана речовина приймається перорально щодня мірними
дозами окремими групами піддослідних тварин, один рівень дози на
групу впродовж 90 днів. Впродовж періоду приймання речовини за
тваринами здійснюється ретельний нагляд на предмет виявлення ознак
отруєння. Проводиться розтин тварини, що помирають, або яких
вбивають впродовж тестування, після завершення досліду тварин, що
вижили, також вбивають, після чого проводиться їх розтин.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Вибір видів тварин
Звичайно, при дослідженні тварин, що не є гризунами,
використовують собак певної породи: часто використовуються гончі
собаки. Також можуть використовуватись інші види тварин,
наприклад, свині, малі свині. Використання приматів не
рекомендується, а якщо вони використовуються, то їх використання
необхідно обґрунтувати. Для дослідів відбираються молоді здорові
тварини, у випадку використання собак, бажано використовувати
тварин від чотирьох до шести місяців, але не старше дев'яти
місяців. Якщо це дослідження передує довгостроковому дослідженню
хронічної токсичності, в обох дослідах необхідно використовувати
ті самі види/породи тварин.
1.4.2. Підготовка тварин
Для проведення попередніх експериментальних процедур
необхідно використовувати здорових молодих тварин, що пройшли
акліматизацію в лабораторних умовах. Тривалість акліматизації
залежить від відібраних видів тварин і їхнього джерела.
Рекомендованим періодом є щонайменш п'ять днів для собак і свиней
вищезазначених порід, взятих з постійних колоній і щонайменш два
тижні для тварин з зовнішніх джерел. Піддослідні тварини повинні
бути охарактеризовані за породою, штамом, джерелом, статтю, вагою
і/або віком. Тварини повинні бути випадково відібрані для
контрольних і дослідних груп. Клітки повинні бути розташовані
таким чином, щоб мінімізувати можливі ефекти, викликані
розташуванням клітки. Кожній тварині присвоюється унікальний
ідентифікаційний номер.
1.4.3. Підготовка доз
Дослідна речовина подається з їжею, питтям, через зонд або в
капсулах. Метод перорального вживання залежить від мети
дослідження і фізико-хімічних властивостей дослідного матеріалу.
При необхідності дослідна речовина розчиняється або
підвішується у відповідному середовищі. Рекомендується за
можливістю спочатку розглянути можливість використання водного
розчину/суспензії, потім олійного розчину/емульсії (наприклад, в
кукурудзяній олії), а потім використання розчинів в інших
середовищах. Для всіх середовищ, крім води, необхідно визначити
токсичні характеристики. Необхідно визначити стабільність
дослідної речовини в умовах вживання.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Кількість і стать тварин
Принаймні вісім тварин (4 самці і 4 самки) необхідно
використовувати для кожного рівня дози. Якщо планується умертвіння
впродовж досліду, кількість необхідно збільшити на таку кількість
тварин, щоб забезпечити відповідну якість оцінювання токсичного
ефекту. Спираючись на попередній досвід про хімічні і близькі до
них речовини необхідно розглянути можливість включення додаткової
сателітної групи кількістю вісім (по чотири кожної статі) для
контрольної групи і групи, що отримує найвищу дозу з метою нагляду
після досліду на предмет реверсивності або тривалості будь-яких
токсичних наслідків. Час такого нагляду встановлюється у
відповідності до виявлених наслідків.
1.5.2. Рівні доз
Використовуються принаймні три рівні доз з одночасним
поточним контролем, окрім випадку проведення досліду на граничний
вміст (див. 1.5.3). Рівні доз визначаються на підставі повторної
дози, або на підставі досліджень діапазону, а також повинні
враховувати всі існуючі токсикологічні і токсикоз-кінетичні дані,
доступні щодо існуючої речовини або пов'язаних з нею матеріалів.
Враховуючи обмеження, викликані фізико-хімічною природою і
біологічним ефектом дослідної речовини, рівень найвищої дози
вибирається з метою викликання токсичних проявів, але вибрана доза
не повинна призводити до смерті або значних ушкоджень. Зменшення
дозування застосовується з метою демонстрації реакції, пов'язаної
з дозуванням і рівня при якому не спостерігається шкідливих
наслідків (NOAEL) при найнижчій дозі. Двократні або чотирикратні
інтервали є оптимальними для встановлення рівнів дозування, що
знижуються, а введення четвертої дослідної групи є часто
необхідним при використанні дуже значних інтервалів (наприклад,
більше ніж коефіцієнт 6-10) між дозуваннями.
Контрольною групою повинна бути група, яка не піддається дії
препарату, або яка піддається дії середовища, якщо для вживання
дослідної речовини використовується середовище. Тварини в
контрольній групі поза часом ненадання їм дослідної речовини
знаходяться в тих самих умовах, що і тварини в дослідних групах.
Якщо використовується середовище-носій, контрольна група повинна
отримати його в максимально можливому об'ємі. Якщо дослідна
речовина подається з харчуванням і призводить до зменшення
раціону, контрольна група з харчової пари може бути корисною при
розрізненні між зменшенням, що викликане смаком і зменшенням,
викликаним токсикологічними змінами в моделі дослідження.
Наступні характеристики середовища-носія та інших добавок
повинні розглядатись як відповідні: вплив на засвоюваність,
розподіл, метаболізм, або утримання дослідної речовини; вплив на
хімічні якості дослідної речовини, що можуть змінити її токсичні
характеристики; і вплив на споживання їжі або води або харчового
статусу тварин.
1.5.3. Дослід на граничний вміст
Якщо тестування при одному Рівні доз, еквівалентному
1 000 мг/кг маси тіла/день при використанні процедур, описаних для
цього досліду призводить до непомітного шкідливого ефекту, а також
якщо наявність токсичності не очікується на підставі даних щодо
структурно-пов'язаних речовин, в проведенні повного дослідження
трьох рівнів доз нема необхідності. Дослід на граничний вміст
застосовується за винятком ситуацій, коли небезпека для людей
викликає потребу застосування вищого рівня дози.
1.5.4. Вживання доз
Тваринам надається дослідна речовина через сім днів кожного
тижня впродовж 90 днів. Кожний інший спосіб дозування, наприклад,
п'ять днів на тиждень вимагає обґрунтування. Якщо дослідна
речовина подається через зонд, процедура виконується поданням
одиничної дози з використанням трубки або катетера. Максимальний
об'єм рідини, що надається за один раз, залежить від розміру
піддослідної тварини. Звичайно об'єм повинен бути мінімально
можливим. За виключенням речовин, що викликають подразнення або
корозію, які звичайно викликають загострення при більш значних
концентраціях, необхідно мінімізувати змінність об'єму дослідної
речовини шляхом регулювання концентрації для того, щоб забезпечити
постійність об'єму на всіх рівнях дозування.
Для речовин, які подаються з їжею або питною водою, важливо
забезпечити, щоб об'єм дослідної речовини не перешкоджав
нормальному харчуванню або водному балансу. Якщо дослідна речовина
подається з їжею - застосовується або постійна концентрація в їжі
(ppm), або постійний рівень дози відносно маси тіла тварини; якщо
застосовуються альтернативні варіанти, це повинно бути зазначено
окремо. Для речовин, які подаються через зонд або в капсулах, доза
повинна подаватись кожного дня в той самий час і регулюватись
таким чином, щоб забезпечити постійний рівень дозування відносно
маси тіла тварини. При проведенні попереднього 90-денного
дослідження перед дослідженням хронічної токсичності, в обох
випадках повинна застосовуватись та сама дієта.
1.5.2. Огляди
Період нагляду повинен складати щонайменш 90 днів. Для тварин
в сателітній групі складається графік оглядів, при цьому у
відповідний період тварини не піддаються дії препарату для
виявлення їхньої стійкості до токсичного ефекту або здатності
відновлюватись після нього.
Загальні клінічні огляди проводяться принаймні раз на день,
бажано в один і той самий час, приймаючи до уваги піковий період
очікуваного ефекту після дозування. Клінічний стан тварин
необхідно реєструвати. Принаймні два рази на день, звичайно, на
початку і в кінці кожного дня всі тварини оглядаються на предмет
клінічних проявів і смертності.
Принаймні раз перед першим проявом (в межах порівняння) і
один раз на тиждень після цього всі тварини повинні пройти
ретельне клінічне обстеження. Ці обстеження проводяться за межами
клітки, де живе тварина, бажано в стандартному місці і в один і
той самий час. Необхідно докласти зусиль для мінімізації зміни
умов, в яких проводиться огляд. Ознаки токсикації повинні бути
ретельно записані, включаючи час прояву ознаку, ступінь і
тривалість. Огляди повинні включати в себе огляд на предмет зміни
шкіри, хутра, очей, слизистих оболонок, наявність секреції і
екскрецій, а також автономної активності (наприклад, очі, що
сльозяться, пілоерекція, зміна розміру зіниць, зміна дихання), але
не обмежуватись ними. Необхідно також зареєструвати такі прояви,
як: зміна ходи, постави і реакції на догляд, а також наявність
клонічних або тонічних рухів, стереотипної поведінки (надмірне
вмивання, повторюваний рух по колу).
Офтальмологічні дослідження за допомогою офтальмоскопу або
подібного приладу повинно здійснюватись перед вживанням доз
досліджуваної речовини і після закінчення дослідів, найкраще для
всіх тварин, але принаймні в групі з високим рівнем дозування і в
контрольній групі. При виявленні змін в очах, необхідно повторно
дослідити всіх тварин.
1.5.5.1. Вага тіла і споживання їжі/води
Всіх тварин зважують принаймні раз на тиждень. Оцінювання
об'єму споживання їжі проводиться принаймні раз на тиждень. Якщо
дослідна речовина приймається з водою, також принаймні раз на
тиждень необхідно оцінити об'єм споживання води. Споживання води
також приймається до уваги при дослідах, де речовина подається з
їжею або через зонд, впродовж яких режим прийому води може бути
змінено.
1.5.5.2. Гематологія і клінічна біохімія
Зразки крові відбираються з зазначеного місця і зберігаються,
якщо це необхідно, у відповідних умовах. На кінець дослідного
періоду зразки збираються до або в процесі процедури для
умертвіння тварин.
Гематологія, включаючи гематокрит, концентрацію гемоглобіну,
кількість еритроцитів, загальну і диференційну кількість
лейкоцитів, кількість тромбоцитів і потенціал згортання крові: час
згортання крові, протромбінів час або тромбопластиновий час,
повинна бути досліджена на початку дослідження, а потім щомісяця
або всередині дослідного періоду і в кінці дослідного періоду.
Визначення клінічної біохімії для основних досліджень
токсичних наслідків в тканинах, а саме, дія на нирки і внутрішні
органи, проводиться на пробах крові тварин, отриманих на початку
досліду, після щомісячних досліджень і в кінці дослідного періоду.
При дослідженні розглядаються електролітний баланс, вуглеводний
обмін речовин, функція печінки і нирок. На вибір того чи іншого
досліду впливає визначений спосіб дії дослідної речовини. Тварини
повинні утримуватись від вживання їжі до відбору проб крові.
Пропонується визначити наявність: кальцію, фосфору, хлориду,
натрію, калію, глюкози, що міститься в організмі до вживання їжі,
аланін амінотрансфераза, аспартат амінотрансфераза, орнітин
декарбоксилаза, гама глуматил транспептидаза і
сорбітолдегідрогеназа, азоту сечовини, альбуміну, кретину в крові,
загальний об'єм білірубіну і загальний об'єм протеїну сироватки.
Аналіз сечі необхідно провести на початку, в середини і в
кінці досліду, сеча відбирається у відповідності до визначеного
графіку. В результаті такого аналізу оцінюється: зовнішній вигляд,
об'єм, осмолялність або питома густина, рН, наявність білку,
глюкози і крові, кров'яних клітин. Додаткові параметри можуть
також бути визначені при необхідності для продовження дослідження
виявленого ефекту.
Крім того, необхідно взяти до уваги результати дослідів щодо
визначення ознак загального ушкодження тканин. Крім того, для
здійснення відповідного токсикологічного аналізу необхідно
провести аналіз: ліпідів, гормонів, кислотно-лужного балансу,
метагемоглобіну, холінестеразне інгібірування. Додаткові клінічні
біохімічні показники можуть бути визначені при необхідності для
продовження дослідження виявленого ефекту.
Взагалі необхідно застосовувати гнучкий підхід в залежності
від видів тварин і ефекту від даної речовини, що виявляється і/або
передбачається.
1.5.5.3. Загальний розтин
Всі піддослідні тварини підлягають повному детальному
загальному розтину, який включає в себе детальне вивчення
зовнішньої поверхні тіла, всіх отворів, а також черепної, грудної
і черепної порожнин і їхнього вмісту. Печінку, нирки, надниркові
залози, яєчка, придатки, матку, яєчники, зобну залозу, селезінку,
мозок і серце всіх тварин (крім тих, які вмирають і/або були
випадково вбиті) необхідно обробити клейкою тканиною, після цього
вони повинні якнайшвидше після розтину бути зважені в мокрому
стані для уникнення висихання.
Наступні тканини повинні бути законсервовані в найбільш
придатному середовищі, що є придатним для тканин обох типів і
запланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальні
ушкодження, мозок (всі репрезентативні ділянки, включаючи півкулі
головного мозку і спинний мозок/варулієв міст), хребет (на трьох
рівнях: шийному, середньо-грудному і поперековому), слизові
оболонки, очі, щитовидні залози, пара-щитовидні залози, зобні
залози, стравохід, слинні залози, шлунок, великий і малий кишечник
(включаючи Пейерові бляшки), печінку, жовчний міхур, підшлункову
залозу, нирки, печінкову залозу, селезінку , серце, трахею і
легені, аорту, гонади, матки, інші статеві органи, жіночі грудні
залози, простату, сечовий міхур, лімфатичні вузли (бажано один
лімфатичний вузол, що покриває шлях прийому препарату, а другий
вузол такий, що знаходиться на відстані від шляху прийому
препарату для, того, щоб прослідкувати систематичний вплив),
периферійний нерв (сідничний або тибіальний) бажано якнайближче до
м'язу, ділянку кісткового мозку (і/або свіжий аспірат кісткового
мозку) і шкіру. Клінічні та інші результати можуть викликати
необхідність дослідження додаткових тканин. Також повинні бути
збережені будь-які органи, що можуть вважатись органами-мішенями
на підставі відомих властивостей дослідної речовини.
1.5.5.4. Гістопатологія
Необхідно провести повну гістопатологію збережених органів і
тканин всіх тварин контрольної групи і групи, що отримувала
найбільшу дозу. Ці дослідження проводяться для тварин всіх інших
груп дозування при наявності змін в групі, що отримувала найбільшу
дозу, пов'язаних з дією препарату.
Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.
При використанні сателітної групи проводиться гістопатологія
на тканинах і органах, визначених, як такі, що реагують, в групах,
що приймали препарат.
2. ДАНІ І ЗВІТНІСТЬ
2.1. ДАНІ
Необхідно представити індивідуальні дані. Додатково всі дані
повинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальна
кількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількість
тварин, що вмерли під час досліду або кількість тварин, яких
безболісно умертвили, а також час, впродовж якого настала смерть
або безболісне умертвіння, кількість тварин, що має ознаки
отруєння, опис ознак отруєння, що спостерігаються, включаючи час
появи, тривалість, ступінь тяжкості кожного токсичного випадку,
кількість тварин, у яких виявлено патологічні зміни, тип
патологічних змін і відсоток тварин, що складає кожний тип
патологічних змін.
В окремих випадках кількісні результати повинні оцінюватись
відповідними і загальноприйнятими статистичними методами.
Статистичні методи і данні, що піддаються аналізу, повинні
вибиратись під час приготування проекту досліджень.
2.2. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформацію:
2.2.1. Речовина, що вживається при дослідженні:
- фізичний характер, чистота і фізико-хімічні властивості,
- ідентифікаційні дані,
- середовище (якщо застосовується): обґрунтування вибору
середовища, якщо відрізняється від води.
2.2.2. Види тварин, що використовуються при дослідженні:
- породи і штам, що використовувались,
- кількість, вік і стать тварин,
- джерело, умови проживання, харчування і т.ін.,
- вага кожної тварини на початку дослідження.
2.2.3. Умови дослідження:
- раціональне обґрунтування вибраного рівня дозування,
- докладна інформація щодо складу дослідної
речовини/приготування їжі, прийнята концентрація, стабільність і
однорідність приготування,
- докладна інформація щодо подачі дослідної речовини,
- дійсна доза (мг/кг вага тіла/день), показник конверсії
їжа/питна вода концентрації дослідної речовини (ppm) до дійсної
дози, якщо застосовується,
- докладна інформація щодо якості їжі і води.
2.2.4. Результати:
- вага тіла і зміна ваги тіла,
- споживання їжі і пиття, якщо застосовується,
- реакція на отруєння згідно зі статтю і рівнем дози,
включаючи ознаки отруєння,
- характер, ступінь і час тривання клінічних ознак
(виліковний або невиліковний стан),
- результати офтальмологічного досліду,
- гематологічні дослідження з відповідними допусками рівнів,
- біохімічні клінічні дослідження з відповідними допусками
рівнів,
- остаточна вага тіла, вага органів і пропорції ваги
орган/тіло,
- результати розтину,
- детальний опис гістопатологічних результатів,
- дані, що стосуються засвоєння, якщо доступні,
- статистична обробка результатів, де необхідно.
Обговорення результатів.
Висновки.

В.28. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ДЕРМАЛЬНУ
ТОКСИЧНІСТЬ: 90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ З ПОВТОРЮВАНОЮ
ДЕРМАЛЬНОЮ ДОЗОЮ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідна речовина щоденно наноситься на шкіру рівномірними
дозами декільком групам піддослідних тварин, одна доза на групу
впродовж 90 днів. В період приймання дози тварини піддаються
щоденному огляду з метою виявлення ознак токсичності. Тварини, що
помирають впродовж досліду піддаються розтину, а після закінчення
досліду тварини, що залишились, умертвляються і також піддаються
розтину.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
Тварини знаходяться в умовах проживання і харчування,
визначених для дослідження щонайменш впродовж п'яти днів до
початку дослідження. Перед початком дослідження молоді і здорові
тварини випадково розподіляються за дослідними і контрольними
групами. До початку досліду шерсть піддослідних тварин
підстригається в потиличній зоні тулуба. Можна застосувати
гоління, але воно повинно бути виконано за 24 години перед
початком досліду. Наступна стрижка або гоління виконується, як
правило, через тиждень. Під час стрижки або гоління необхідно
зважати на те, щоб не пошкодити шкіру. Необхідно очистити не менше
10% поверхні шкіри для випробування дослідної речовини. Необхідно
взяти до уваги масу тварин під час прийняття рішення щодо поверхні
шкіри, яка очищується, а також щодо поверхні її покриття.
Досліджуючи тверді речовини, які можуть витертись в окремих
випадках, дослідну речовину необхідно змочити водою або у
відповідному середовищі, щоб забезпечити відповідний контакт зі
шкірою. Рідкі дослідні речовини, як правило, застосовуються в
нерозчиненому вигляді. Звичайно речовина наноситься від п'яти до
семи днів на тиждень.
1.6.2. Умови проведення досліду
1.6.2.1. Піддослідні тварини
Можна використовувати дорослих щурів, кроликів або морських
свинок. На початку дослідження розбіжність в вазі не повинна
перевищувати +- 20% середньої ваги. У випадку проведення
суб-хронічних досліджень в якості попередніх досліджень перед
тривалими дослідженнями, не обхідно використовувати тварин того
самого штаму і джерела.
1.6.2.2. Кількість і стать
Принаймні 20 тварин (10 самців і 10 самок) зі здоровою шкірою
необхідно використовувати для кожного рівня дози. Самки не повинні
бути вагітними і не повинні бути такими, що народжували раніше.
Якщо планується умертвіння впродовж досліду, кількість необхідно
збільшити на кількість тварин, що планується вмертвити до
закінчення досліду. Сателітна група кількістю 20 тварин (по
10 тварин кожної статі) може піддаватись дії підвищеної дози
впродовж 90 днів з подальшим оглядом на предмет відновлення,
стійкості, або запізненого прояву наслідків токсичності через
28 днів після виконання процедур досліду.
1.6.2.3. Рівні доз
Використовуються принаймні три рівні доз разом з контрольною
дозою або контролем середовища, якщо воно застосовується. Час
експозиції речовини повинен дорівнювати принаймні шести годинам
щоденно. Речовину необхідно застосовувати в той самий час кожного
дня, а кількість речовини, що застосовується регулюється у
відповідності до інтервалів часу (тижневих або двотижневих) для
підтримання однакового рівня дозування у відповідності до маси
тіла тварини. Крім дії дослідною речовиною, тварини в контрольній
групі знаходяться в тих самих умовах, що і тварини в дослідних
групах. Якщо для полегшення дозування використовується
середовище-носій, контрольна група, що приймає його, отримує таке
саме дозування, що і дослідні групи і таку саму дозу, що і група,
яка отримує найбільшу дозу. Найвища доза повинна викликати
токсичний ефект, але не призводити (або призводити до незначних)
летальних наслідків. Найнижчий рівень дози не повинен викликати
очевидних проявів токсичності. У випадку оцінювання впливу на
людину, найнижчий рівень повинен перевищувати рівень, що
застосовується для людини. В ідеальному випадку середній рівень
дози повинен викликати мінімальний очевидний токсичний ефект. При
використанні декількох середніх доз, рівні доз повинні визначатись
таким чином, щоб забезпечити градацію токсичних ефектів. В групах,
що отримують низьку і середню дозу і в контрольній групі рівень
летальних випадків повинен бути низьким для можливості якісної
оцінки результатів.
Якщо застосування дослідної речовини призводить до значних
подразнень шкіри, необхідно зменшити концентрацію, що може
призвести до зниження або зникнення інших токсичних ефектів в
групі, що приймає найвищу дозу. Якщо шкіра отримує нове
ушкодження, може виникнути необхідність в завершені поточних
дослідів і початку дослідів при більш низькій концентрації.
1.6.3. Дослід на граничний вміст
Якщо в результаті попереднього тестування при Рівні доз,
еквівалентному 1 000 мг/кг або при вищому рівні, яке проводилось в
зв'язку з можливою дією на організм людини, не було виявлено
токсичного ефекту, наступні дослідження можуть виявитись
непотрібними.
1.6.4. Період нагляду
Піддослідні тварини повинні щодня піддаватись огляду з метою
виявлення ознак токсичності. Необхідно записувати час смерті, час
появи і зникнення ознак токсичності.
1.6.5. Процедура
Тварини розміщуються в окремих клітках. Тварини піддаються
дії дослідної речовини в ідеальному випадку впродовж 90 днів
7 днів на тиждень.
Для тварин в будь-якій сателітній групі складається графік
оглядів, якого слід дотримуватись впродовж наступних 28 днів, не
піддаючи тварин дії дослідної речовини для визначення відновлення
або не відновлення після токсичного ефекту. Час експозиції повинен
складати шість годин на день.
Дослідна речовина рівномірно розподіляється на ділянці шкіри,
що складає приблизно 10% від загальної площі тіла. З
високотоксичними речовинами площа поверхні повинна бути меншою,
але вони повинна бути покрита, якщо це можливо, тонкою рівномірною
плівкою.
Під час експозиції дослідна речовина входить в контакт зі
шкірою за допомогою марлі і тасьми, що не викликає подразнень.
Наступне досліджуване місце повинно бути накрито відповідним чином
з метою утримання марлі і дослідної речовини і для того, щоб
тварини не були здатні проковтнути дослідну речовину. З метою
уникнення проковтування дослідної речовини можна застосувати
спеціальні засоби безпеки, але утримання тварин в повній
нерухомості не рекомендується.
Після закінчення часу експозиції решту дослідної речовини
слід усунути, у випадку, коли це можливо - за допомогою води або
іншого методу для очищення шкіри.
Всі тварини повинні піддаватись щоденному огляду, а прояви
токсичності повинні реєструватись, включаючи час їх з'явлення,
ступінь і час тривання. При огляді тварин в клітках необхідно
виявляти зміни, що з'явились на їхній шкірі і хутрі, зміни в очах
і слизовій оболонці, а також зміни дихальної системи, кровообігу,
автономної і центральної нервової системи, соматомоторної
активності і схеми поведінки. Щотижня необхідно проводити
оцінювання обсягу харчування і зважування тварин. Регулярний огляд
тварин є необхідним для забезпечення того, щоб тварини впродовж
досліду не загинули з причин канібалізму, автолізу тканин або
зміщення. В кінці дослідного періоду всі тварини, що вижили, в
групах, що не є сателітними, піддаються розтину. Тварини, що
вмирають видаляються з групи і також піддаються розтину.
Звичайно виконуються наступні види огляду, включаючи
контроль:
(а) офтальмологічний огляд з використанням офтальмоскопу або
еквівалентного придатного обладнання здійснюється до нанесення
дослідної речовини і після закінчення досліду, бажано для всіх
тварин, але принаймні, для групи, що отримувала найвищу дозу і для
контрольної групи. При виявлені будь-яких змін в очах, необхідно
оглянути всіх тварин.
(b) гематологічний огляд, включаючи гематокрит, концентрацію
гемоглобіну, кількість еритроцитів, загальну і диференційну
кількість лейкоцитів, кількість тромбоцитів і потенціал згортання
крові: час згортання крові, протромбінів час або тромбопластиновий
час проводиться в кінці дослідного періоду.
(с) Визначення клінічної біохімії крові проводиться в кінці
дослідного періоду. При дослідженні розглядаються електролітний
баланс, вуглеводний обмін речовин, функція печінки і нирок. На
вибір того чи іншого досліду впливає визначений спосіб дії
дослідної речовини. Тварини повинні утримуватись від вживання їжі
до відбору проб крові. Пропонується визначити наявність: кальцію,
фосфору, хлориду, натрію, калію, глюкози (в період утримання від
їжі в залежності від виду тварини), глютамінової пировиноградної
транзамінази сироватки(1), глютамінової щавелево-уксусної
транзамінази сироватки(2), орнітин декарбоксилаза, гама глуматил
транспептидаза, азоту сечовини, альбуміну, кретину в крові,
загальний об'єм білірубіну і загальний об'єм протеїну сироватки.
Крім того, для здійснення відповідного токсикологічного аналізу
необхідно провести аналіз: ліпідів, гормонів, кислотно-лужного
балансу, метагемоглобіну, холінестеразне активності. Додаткові
клінічні біохімічні показники можуть бути визначені при
необхідності для продовження дослідження виявленого ефекту.
---------------- (1) Зараз відомий як аланін амінотрансфераза сироватки.
(2) Зараз відомий як аспарат амінотрансфераза сироватки.
(d) Звичайно, в проведені аналізу сечі нема необхідності,
окрім випадків, коли проведення такого аналізу рекомендується в
зв'язку з наявною або очікуваною токсичністю.
Якщо історичні вихідні дані не відповідають вимогам,
необхідно звернути увагу на те, чи є необхідність до початку
дозування у визначенні параметрів гемулогічної і клінічної
біохімії;
Загальний розтин
Всі піддослідні тварини підлягають повному детальному
загальному розтину, який включає в себе детальне вивчення
зовнішньої поверхні тіла, всіх отворів, а також черепної, грудної
і черепної порожнин і їхнього вмісту. Печінку, нирки і надниркові
залози повинні якнайшвидше після розтину бути зважені в мокрому
стані для уникнення висихання. Наступні органи і тканини повинні
бути законсервовані в найбільш придатному середовищі для можливих
запланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальні
ушкодження, мозок, включаючи ділянки спинного мозку/варулієва
моста, слизові оболонки, щитовидні залози/пара-щитовидні залози,
будь-які зобні тканини, (трахею) легені, серце, аорту, слинні
залози, печінку, селезінку, нирки, надниркові залози, підшлункові
залози, гонади, матки, інші статеві органи, жовчний міхур (якщо
є), стравохід, шлунок, дванадцятипала кишка, тонка кишка,
підвздошна кишка, сліпа кишка, товста кишка, пряма кишка, сечовий
міхур, лімфатичні вузли (жіночі грудні залози), (стегнова
мускулатура), периферійні нерви, (очі) (грудна кістка з кістковим
мозком) (стегно, включаючи суглобну поверхню), (хребет на трьох
рівнях: шийному, середньогрудному і поперековому), і (сльозова
залоза, пальпебральна частина якої розташована під верхнім
зовнішнім краєм орбіти). Тканини, зазначені в дужках, оглядаються
тільки при виявлені ознак токсичності, або якщо вони є
органами-мішенями.
Гістопатологічні дослідження
(а) Необхідно провести повну гістопатологію нормальної і
досліджуваної ділянки шкіри, а також органів і тканин тварин
контрольної групи і групи, що отримувала найбільшу дозу.
(b) Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.
(c) Органи-мішені в інших групах дозування повинні бути
досліджені.
(d) При використанні щурів, легені тварин в групах, що
отримували середню і низьку дози піддаються гістопатологічному
дослідженню для виявлення інфекції, оскільки це дозволяє якісно
оцінити стан тварин. В наступних гістопатологічних дослідженнях,
звичайно, нема потреби в цих групах, але вони завжди повинні
проводитись на органах, в яких виявлено значне ушкодження в групі,
що отримувала найвищу дозу.
(е) При використанні сателітної групи гістопатологічні
дослідження проводяться на тканинах і органах, що ідентифіковані
як такі, що виявляють ефект в інших піддослідних групах.
2. ДАНІ
2.1. ДАНІ
Необхідно представити індивідуальні дані. Додатково всі дані
повинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальна
кількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількість
тварин, у яких виявлені ушкодження, тип ушкоджень і процентне
відношення тварин, у яких виявлено кожний тип ушкоджень.
Результати оцінюються у відповідності до прийнятного статистичного
методу. Може використовуватись будь-який статистичний метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформацію:
- породи, штам, джерело тварин, що використовувались,
оточуючі умови, дієту,
- умови дослідження,
- рівень дози (включаючи середовище-носія, якщо
використовується) і концентрацію,
- дані щодо токсичної реакції у відповідності до статі і
дозування,
- рівень, при якому відсутній ефект, якщо можливо,
- час смерті впродовж дослідження і факт виживання тварин до
закінчення досліду,
- опис токсичного або інших ефектів,
- час тривалості кожного аномального прояву і їхніх
наслідків,
- відсутність наслідків,
- дані, що стосуються маси тіла і спожитої їжі,
- висновки офтальмологічних досліджень,
- види і всі результати гематологічного досліду,
- види клінічних і біохімічних досліджень, а також всі їх
результати (включаючи результати всіх аналізів сечі),
- результати розтину,
- детальний опис гістопатологічних дослідів,
- статистична обробка результатів, якщо можливо,
- аналіз результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В

В.29. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ТОКСИЧНІСТЬ
ПРИ ВДИХАННІ: 90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ З ПОВТОРЮВАНОЮ
ДОЗОЮ ДЛЯ ВДИХАННЯ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Декілька груп піддослідних тварин піддаються щоденній дії
дослідної речовини в мірних дозах впродовж визначеного часу, один
вид концентрації вживається в даній групі впродовж 90 днів. У
випадку використання середовища-носія з метою отримання
відповідної концентрації дослідної речовини в повітрі, необхідно
використовувати контрольну групу для оцінювання середовища-носія.
В період приймання дози тварини піддаються щоденному огляду з
метою виявлення ознак токсичності. Тварини, що помирають впродовж
досліду піддаються розтину, а після закінчення досліду тварини, що
залишились, умертвляються і також піддаються розтину.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
Тварини знаходяться в умовах проживання і харчування,
визначених для дослідження щонайменш впродовж 5 днів до початку
дослідження. Перед початком дослідження молоді і здорові тварини
випадково розподіляються за дослідними і контрольними групами. При
необхідності до дослідної речовини може бути додано відповідне
середовище-носія для отримання необхідної концентрації речовини в
повітрі. У випадку вживання будь-якого середовища-носія або інших
добавок для полегшення введення дози, необхідно упевнитись, що
вони не викликають жодних токсичних наслідків. Базові дані можуть
використовуватись у відповідності до потреб.
1.6.2. Умови проведення досліду
1.6.2.1. Піддослідні тварини
У випадку відсутності протипоказань бажано використовувати
щурів. Необхідно використовувати види молодих здорових тварин, які
звичайно використовуються для лабораторних дослідів. На початку
дослідження розбіжність в вазі не повинна перевищувати +- 20%
середньої ваги. У випадку проведення суб-хронічних досліджень в
якості попередніх досліджень перед тривалими дослідженнями,
необхідно використовувати тварин того самого штаму і джерела.
1.6.2.2. Кількість і стать
Принаймні 20 тварин (10 самців і 10 самок) піддаються дії
кожної концентрації речовини. Самки не повинні бути вагітними і не
повинні бути такими, що народжували раніше. Якщо планується
умертвіння впродовж досліду, кількість необхідно збільшити на
кількість тварин, що планується вмертвити до закінчення досліду.
Сателітна група кількістю 20 тварин (по 10 тварин кожної статі)
може піддаватись дії підвищеної дози впродовж 90 днів з подальшим
оглядом на предмет відновлення, стійкості, або запізненого прояву
наслідків токсичності через 28 днів після виконання процедур
досліду.
1.6.2.3. Концентрація
У випадку використання середовища-носія вимагаються принаймні
три рівні концентрації, для контрольної групи і контрольної групи
для оцінювання середовища-носія (з концентрацією середовища-носія,
що відповідає концентрації при найбільшій дозі). За винятком
застосування дослідної речовини тварини з контрольної групи
повинні знаходитись в таких самих умовах, що і тварини з дослідної
групи. Найвища концентрація повинна викликати токсичні наслідки,
але не викликати або викликати незначну кількість летальних
випадків. У випадку оцінювання впливу на людину, найнижчий рівень
повинен перевищувати рівень, що застосовується для людини. В
ідеальному випадку середній рівень дози повинен викликати
мінімальний очевидний токсичний ефект. При використанні декількох
середніх доз, рівні доз повинні визначатись таким чином, щоб
забезпечити градацію токсичних ефектів. В групах, що отримують
низьку і середню дозу і в контрольній групі рівень летальних
випадків повинен бути низьким для можливості якісної оцінки
результатів.
1.6.2.4. Час експозиції
Денна норма часу експозиції повинна складати декілька годин
після врівноваження концентрації в комірках. Інші часові рамки
тривалості експозиції можуть застосовуватись з метою виконання
особливих вимог.
1.6.2.5. Обладнання
Тварини досліджуються з використанням інгаляційного
обладнання, розробленого з метою підтримки динамічної циркуляції
повітря при щонайменш 12 змінах повітря на годину з метою
забезпечення відповідної кількості кисню, а також рівномірного
розподілу повітря з вмістом дослідної речовини. У випадку
застосування камери, її проект повинен мінімізувати стикання
піддослідних тварин, а також мінімізувати їх контакт з дослідною
речовиною шляхом інгаляції. Як правило, для стабілізації повітря в
камері, загальна кількість піддослідних тварин не повинна
перевищувати 5% об'єму дослідної камери. Можуть використовуватись
орально-назальні, головні камери, а також камери для всього тіла;
використання перших двох типів камер мінімізує можливість прийому
дослідної речовини іншими шляхами.
1.6.2.6. Період нагляду
Піддослідні тварини повинні щодня піддаватись огляду з метою
виявлення ознак токсичності під час всього періоду дослідження, а
також періоду регенерації. Необхідно записувати час смерті, час
появи і зникнення ознак токсичності.
1.6.3. Процедура
Тварини піддаються дії дослідної речовини щодня, від п'яти до
семи днів на тиждень впродовж 90 днів. Для тварин в будь-якій
сателітній групі складається графік оглядів, якого слід
дотримуватись впродовж наступних 28 днів, не піддаючи тварин дії
дослідної речовини для визначення відновлення або не відновлення
після токсичного ефекту. Температура, при якій проводиться дослід
повинна підтримуватись на рівні 22 +- 3 град.С. В ідеальному
випадку, рівень відносної вологості повинен підтримуватись в межах
30%-70%, але в окремих випадках (наприклад, використовування
аерозолів) цей рівень не застосовується. Під час дії речовини їжа
і вода не приймаються.
Необхідно використовувати систему динамічної інгаляції з
відповідною системою контролю аналітичної концентрації. Для
встановлення відповідної концентрації дії речовини рекомендується
проведення контрольного випробування. Потік повітря необхідно
відрегулювати таким чином, щоб забезпечити однорідні умови в
камері. Система повинна забезпечувати досягнення необхідних умов в
найкоротший можливий строк.
Необхідно виконати вимірювання або моніторинг:
а) темпу зміни повітря (постійного);
b) дійсної концентрації дослідної речовини, виміряної в зоні
дихання. Впродовж денного періоду експозиції концентрація не
повинна відхилятись більше ніж на +- 15% від основного значення.
Однак, у випадку пилу і аерозолів цей рівень контролю може
виявитись недосяжним, в цьому випадку приймається більш широкий
діапазон. Впродовж всього періоду дослідження щоденна концентрація
повинна підтримуватись на максимально можливому постійному рівні.
Впродовж розробки генераторної системи необхідно провести аналіз
розміру часток для встановлення стабільності аерозольної
концентрації. Впродовж експозиції необхідно проводити аналіз так
часто, як це необхідно для визначення постійності розподілу
розміру часток;
(с) температури і вологості;
(d) впродовж подальшої експозиції виконуються огляди з їх
систематичною реєстрацією; окремі записи ведуться для кожної
окремої тварини. Всі тварини оглядаються щодня з записом ознак
токсичності, включаючи час їх з'явлення, ступінь і тривалість.
Огляди тварин в клітках повинні включати в себе: зміни їх шкіри,
очей, слизової оболонки, дихальних шляхів, кровообігу, автономної
і центральної нервової системи, соматомоторних характеристик, а
також схеми поведінки. Необхідно виконувати виміри обсягу
споживання їжі, а також зважування тварин раз на тиждень.
Регулярний огляд тварин є необхідним для забезпечення того, щоб
тварини впродовж досліду не загинули з причин канібалізму,
автолізу тканин або зміщення. В кінці дослідного періоду всі
тварини, що вижили, в групах, що не є сателітними, піддаються
розтину. Тварини, що вмирають видаляються з групи і також
піддаються розтину після настання смерті.
Всі тварини, включаючи тварин з контрольних груп, звичайно
піддаються наступним дослідам:
Звичайно виконуються наступні види огляду, включаючи
контроль:
(а) офтальмологічний огляд з використанням офтальмоскопу або
еквівалентного придатного обладнання здійснюється до початку дії
дослідної речовини і після закінчення досліду, бажано для всіх
тварин, але принаймні, для групи, що отримувала найвищу дозу і для
контрольної групи. При виявлені будь-яких змін в очах, необхідно
оглянути всіх тварин.
(b) гематологічний огляд, включаючи гематокрит, концентрацію
гемоглобіну, кількість еритроцитів, загальну і диференційну
кількість лейкоцитів, кількість тромбоцитів і потенціал згортання
крові: час згортання крові, протромбінів час або тромбопластиновий
час проводиться в кінці дослідного періоду.
(с) Визначення клінічної біохімії крові проводиться в кінці
дослідного періоду. При дослідженні розглядаються електролітний
баланс, вуглеводний обмін речовин, функція печінки і нирок. На
вибір того чи іншого досліду впливає визначений спосіб дії
дослідної речовини. Пропонується визначити наявність: кальцію,
фосфору, хлориду, натрію, калію, глюкози (в період утримання від
їжі в залежності від виду тварини), глютамінової пировиноградної
транзамінази сироватки(1), глютамінової щавелево-уксусної
транзамінази сироватки(2), орнітин декарбоксилаза, гама глуматил
транспептидаза, азоту сечовини, альбуміну, кретину в крові,
загальний об'єм білірубіну і загальний об'єм протеїну сироватки.
Крім того, для здійснення відповідного токсикологічного аналізу
необхідно провести аналіз: ліпідів, гормонів, кислотно-лужного
балансу, метагемоглобіну, холінестеразне активності. Додаткові
клінічні біохімічні показники можуть бути визначені при
необхідності для продовження дослідження виявленого ефекту.
---------------- (1) Зараз відомий як аланін амінотрансфераза сироватки.
(2) Зараз відомий як аспарат амінотрансфераза сироватки.
(d) Звичайно, в проведенні аналізу сечі нема необх